2,4,6-三氯苯酚作為防腐劑、 殺菌劑、 防霉劑[1, 2]廣泛應用于各類制造業(yè)，導致大面積土壤、 地表水、 地下水受到了氯代有機物的污染[3, 4, 5]，在污水廠剩余污泥中亦有發(fā)現(xiàn)[6]. 因其高毒性，持久性和致癌性，2,4,6-TCP被美國、 中國等國家列入優(yōu)先控制污染物[7, 8].
多氯酚很難在好氧條件下降解，而在氧化還原電位低的厭氧環(huán)境中，在相應酶的作用下進行厭氧還原脫氯，代謝速率較高[7]，且厭氧脫氯的原理與應用對于修復土壤或地下水更具現(xiàn)實意義，受到研究者的重視. 通過富集活性污泥可獲得厭氧降解2,4,6-TCP的混合微生物[9]，氯取代基被脫除后，生物毒性大大降低[10, 11]，再通過好氧處理，可實現(xiàn)徹底礦化. 對于復雜的氯代化合物，其礦化過程具有步驟性，每步生成的產物往往越來越不容易脫氯[17]，且脫氯菌與其他厭氧細菌形成復雜的互養(yǎng)關系而受到制約[18, 19]，相關研究有待進一步深入. 目前已從土壤、 地下水中分離鑒定出多種氯酚降解菌[12, 13, 14, 15, 16]，這些微生物以有機物作為電子供體，有機氯代物作為電子受體進行呼吸代謝作用. 其中，Dehalococcoides ethenogenes、 Dehalobacter restrictus等通過還原脫氯酶進行脫氯呼吸，另外，異化鐵還原菌的脫氯作用近年來成為研究熱點[13, 14]，如Gobacter、 Shewanella、 Desulfitobacterium等，這些微生物可同時進行Fe(Ⅲ)還原與脫氯呼吸. 在不同的微生物及環(huán)境條件下，厭氧脫氯轉化過程受到影響，并顯著影響脫氯速率. 因此深入研究2,4,6-TCP在厭氧污泥群中的代謝特性和影響因素對于實現(xiàn)2,4,6-TCP徹底礦化，深入還原脫氯機制具有重要的意義.
本研究通過馴化活性污泥富集2,4,6-TCP還原脫氯污泥，探索厭氧條件下馴化污泥對2,4,6-TCP還原脫氯途徑、 代謝特征和影響因素，探討相關機制，以期為加速還原脫氯的方法、 實現(xiàn)多氯酚的徹底礦化及實際應用提供理論基礎.
1 材料與方法
1.1 基本營養(yǎng)物
研究中所采用的培養(yǎng)基含有以下物質： ①主要營養(yǎng)物質(×10-2 g ·L-1): KCl(0.15)，KH2PO(1.36)，NH4Cl(2.68); ②微量元素(×10-3 g ·L-1): CoCl2 ·6H2O(0.024)，ZnCl2(0.075)，H3BO3(0.019)，NiCl2 ·6H2O(0.024)，Na2Mo4 ·2H2O(0.024)，F(xiàn)eCl2 ·4H2O(1.344)，MnSO4 ·4H2O(0.026)，MgSO4 ·7H2O(1.556)，CaCl2 ·2H2O(2.336)，CuSO4 ·5H2O(0.009)，AlK(SO4)2 ·12H2O(3.446); ③ 維生素(×10-3 mg ·L-1)[20]: 生物素(20)，葉酸(20)，維生素B6(100)，維生素B1(50)，維生素B12(1)，對氨基苯甲酸(50)，泛酸(50)，維生素B6(100)，硫辛酸(50); ④酵母浸膏: 0.002%. 其余物質根據實驗內容另行添加.
1.2 污泥馴化
污泥取自上海市長橋污水處理廠二沉池回流污泥，其中未測得氯酚類物質. 馴化前，將污泥淘洗3次，接種至可密封厭氧瓶內，添加1.1節(jié)所述營養(yǎng)物質. 添加乳酸鈉(20 mmol ·L-1)、 2,4,6-TCP(50 μmol ·L-1)，所有物質添加完畢后定容至1 L，氮氣吹脫20 min密封，置于恒溫磁力攪拌器上，內置磁力攪拌子，30℃條件培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液. 培養(yǎng)液加入前經高純N2吹脫20 min，更換時以N2保護，維護反應所需的厭氧條件. 定期檢測酚類物質濃度變化，直至馴化完成.
1.3 實驗方法
間歇實驗按照以下步驟進行： ①配制培養(yǎng)基: 按1.1節(jié)所述配方以去離子水配制基本營養(yǎng)物培養(yǎng)基，分裝至100 mL厭氧瓶內，高純氮氣吹脫20 min密封，121℃滅菌后待用. 實驗時，根據實驗內容，N2保護下分別添加各類物質： 乳酸鈉(10 mmol ·L-1或20 mmol ·L-1); 2,4,6-TCP、 2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)、 4-氯苯酚(4-CP)、 苯酚，添加濃度為40-80 μmol ·L-1; 檸檬酸三鐵(FeC6H5O7，1、 5、 10 mmol ·L-1)、 腐殖質模式物蒽醌-2，7-雙磺酸鈉(2，7-AQDS，1、 5、 10 mmol ·L-1). 所有實驗均為3組平行，結果取平均值，所有物質添加完畢后接種馴化污泥. ②污泥接種: 取出適量馴化污泥，無氧條件下淘洗，置于混勻器(GS-10)上，N2保護條件下利用注射器抽取10 mL，接種至100 mL厭氧瓶內，以去離子無氧水定容至50 mL. ③ 置于恒溫培養(yǎng)箱(HZQ-X160)內振蕩培養(yǎng)，定時取樣檢測. ④取樣: N2保護下，利用無菌注射器抽取液體樣品，利用微濾膜(0.45 μm)過濾待測. 以Agilent 1100高效液相色譜儀(波長282 nm的紫外熒光器，ZORBAXSB-C18反相色譜柱)檢測液相2,4,6-TCP、 2,4-DCP、 4-CP和苯酚濃度，流動相為甲醇水溶液，體積比為甲醇 ∶水(含1%醋酸)=80 ∶20，溫度為25℃，流動速率為1mL ·min-1，檢出限0.1mg ·L-1，加標回收率>98%. 采用Cervantes等[21]描述的方法于450 nm波長處用UNICO 1200 型分光光度計測定其還原態(tài)AH2QDS 的吸光度. 采用ICS-1000離子色譜測定液相總Fe(Ⅱ)濃度，樣品量50 μL，分離柱IonPac CS5A+CG5A，流速1.2mL ·min-1，柱后與PAR反應(530 nm). 采用Multi N/C UV HS 型TOC儀(NDIR檢測器)測定樣品中的總有機碳(TOC)，樣品量500 μL，檢測限0.05mg ·L-1.
1.4 主要試劑
蒽醌-2，7-雙磺酸鈉，分析純，購于東京化成工業(yè)株式會社; 2,4,6-三氯苯酚、 2,4-二氯苯酚、 4-氯苯酚、 檸檬酸鐵等其他藥劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司; 高純氮氣購于上海南匯化工輕工有限公司.
2 結果與討論
2.1 污泥厭氧降解2,4,6-TCP特性
馴化初期，2,4,6-TCP需30 d實現(xiàn)初始性降解，馴化至90 d時，2,4,6-TCP 24 h內轉化率達到100%，此時認為污泥馴化完成. 9個月的實驗中，100%轉化2,4,6-TCP一般耗時為9-24 h. 厭氧條件下，大多數(shù)氯酚都可通過還原脫氯過程逐步脫氯，降低毒性. 已有研究顯示[22]，2,4,6-TCP厭氧脫氯的中間產物可能有2,4-DCP、 4-氯酚、 苯酚，苯酚開環(huán)轉化為苯甲酸進而通過厭氧產甲烷作用生成CH4和CO2. 本研究中，產物經HPLC檢測有2,4-DCP、 4-CP、 苯酚，有少量CH4和CO2產生(未做準確測定)，2,4,6-TCP降解曲線及中間產物變化見圖 1. 其中，初始濃度為66 μmol ·L-1的2,4,6-TCP 24 h內轉化率為100%. 2,4-DCP濃度較低，多批次的實驗中2,4-DCP濃度一般在0-4.22 μmol ·L-1，4-CP會逐漸累積，少量轉化為苯酚. 9個月多批次實驗中，2,4,6-TCP始終未實現(xiàn)最終性降解，終產物為4-CP和少量苯酚，這與相關研究相符[19, 22, 23, 24, 25, 26, 27]，TOC在這一過程中降解率較低(<20%)，可見，單獨厭氧降解可實現(xiàn)快速脫氯，但難以實現(xiàn)2,4,6-TCP及有機物的的徹底礦化. 與已有研究相比(見表 1)，馴化污泥具有快速轉化2,4,6-TCP的能力，這說明通過本實驗的馴化方法可富集大量厭氧脫氯細菌. 厭氧降解殘留物主要包含4-CP、 苯酚和有機物，通過好氧污泥(未馴化)處理后，殘留的4-CP(反應初始濃度33 μmol ·L-1)2 h后無檢出，6 h TOC去除率>90%，無酚類物質和苯系物檢出. 因此，加速2,4,6-TCP的厭氧脫氯是實現(xiàn)其徹底礦化的關鍵，深入研究厭氧脫氯的影響因素和相關機制具有重要的意義.
圖 1 污泥厭氧/好氧降解2,4,6-三氯酚及中間產物變化
表 1 馴化的厭氧污泥或富集培養(yǎng)物降解
根據Lffler等[28]的理論，乳酸鈉為氯代有機物提供電子，通過微生物的呼吸鏈傳遞給氯代有機物使其還原脫氯，這一過程產生的能量被微生物轉化為ATP. 根據空間位阻效應理論，2,4,6-TCP先是逐個脫去鄰位的氯，然后再脫去對位氯. 而本體系中，在降解初始4-CP濃度即增加，2,4-DCP一直有檢出，但濃度一直很低，且未發(fā)現(xiàn)累積過程，推斷存在2,4,6-TCP同時脫去兩個鄰位的氯的途經[29]. 同時，本實驗中，2,4-DCP在體系中的出現(xiàn)說明存在2,4,6-TCP經由2,4-DCP中間體進而脫氯生成4-CP這一途徑. 上述兩種途徑可能同時發(fā)生，因此推測轉化途徑見圖 2.
圖 2 2,4,6-三氯酚厭氧/好氧降解途徑及電子數(shù)變化
2.2 污泥對中間產物的降解
研究中以乳酸鈉為電子供體，接種馴化污泥，分別添加2,4,6-TCP及其厭氧降解的中間產物2,4-DCP、 4-CP和苯酚及基本營養(yǎng)物質，于100 mL厭氧瓶內進行間歇培養(yǎng)實驗(具體方法見1.3節(jié))，考察各中間產物的降解特性. 結果發(fā)現(xiàn)，33 h馴化污泥對含鄰位氯氯酚(2,4,6-TCP、 2,4-DCP，初始濃度為84.1 μmol ·L-1、 45.3 μmol ·L-1)的初始性降解為100%，產物主要為4-CP(圖 3); 對位氯酚(4-CP，初始濃度為45.7 μmol ·L-1)降解率為22%，產物為少量苯酚; 而苯酚(初始濃度68.4 μmol ·L-1)基本未降解.
圖 3 馴化污泥對中間代謝產物的降解
Mohn等[30]發(fā)現(xiàn)對位氯在厭氧環(huán)境難以脫氯，4-CP分子結構的穩(wěn)定性使得在酶作用下氯原子難以被親核取代. 當鄰位和對位或間位共存時，鄰位優(yōu)先脫氯，因為該路徑具有較小的氧化還原電勢. 本研究中僅添加4-CP，無競爭存在，電子供體充足，無產物抑制，說明馴化污泥的對位氯降解功能有限，具有明顯的底物專一性. Li等[23]的研究顯示，一些脫氯菌的種屬對含對位氯的氯酚的降解止步于4-CP. 根據不同氯取代位置，厭氧脫氯一般需要不同的菌群或催化酶. Kim等[31]發(fā)現(xiàn)，降解2,4,6-TCP的Pseudomonas solanacearum TCP114和降解4-CP的Pseudomonas testosteroni CPW301不僅有嚴格的底物專一性，且2,4,6-TCP對4-CP降解菌產生毒性，兩類細菌難以共存. 因此，本研究的馴化污泥以脫鄰位氯降解菌為優(yōu)勢，盡管馴化過程4-CP一直存在，但未富集出降解4-CP的優(yōu)勢種群. 苯酚在本體系幾乎不降解，分析也是上述原因. 這一結果有重要的意義，在2,4,6-TCP的厭氧降解中，4-CP和苯酚的最終性轉化成為限制步驟. 因此，探明2,4,6-TCP和4-CP降解菌的生態(tài)關系、 強化微生物脫對位氯功能，是今后的研究重點.
2.3 電子介體影響
在已分離出的厭氧脫氯菌中發(fā)現(xiàn)很多種屬被證實在脫氯呼吸時伴隨三價鐵[Fe(Ⅲ)]的還原，一些電子介體顯著影響脫氯代謝[29]. 這類微生物分布廣泛，在不同的科、 屬中均有發(fā)現(xiàn)，是生態(tài)環(huán)境中重要的微生物群體. 其功能多樣，除Fe(Ⅲ)，可將電子傳遞給不同的電子受體(如腐殖質). 研究中采用間歇實驗，以乳酸鈉為電子供體，以Fe(Ⅲ)(檸檬酸三鐵)和腐殖質模式物蒽醌-2，7-雙磺酸鈉(2，7-AQDS)作為電子介體考察二者對馴化污泥降解2,4,6-TCP的影響(具體方法見1.3節(jié))，另分別以Fe(Ⅲ)和AQDS為唯一電子受體考察未經馴化的污泥和馴化污泥對二者的還原能力，結果如下.
2.3.1 Fe(Ⅲ)
由圖 4可見，同對照組(未經馴化的接種污泥)相比，馴化的污泥可快速將Fe(Ⅲ)還原為Fe(Ⅱ)，這說明污泥富集了一定數(shù)量的鐵還原菌. 由圖 5可見，隨Fe(Ⅲ)濃度的增加，2,4,6-TCP的降解速率逐漸加快，F(xiàn)e(Ⅲ)濃度為1 mmol時即可明顯強化2,4,6-TCP的降解，濃度為10 mmol ·L-1時，24 h實現(xiàn)100%轉化，與對照樣相比縮短了9 h. Fe(Ⅲ)一方面可作為酶的激活劑促進代謝速率，另一方面可在一些微生物的作用下，作為呼吸鏈的電子受體接受降解有機物釋放的電子[32]，再將電子傳遞給氯酚，加速脫氯過程中的電子傳遞. 鐵元素并未被微生物同化，這一過程發(fā)生在細胞外，因此其機制與“脫氯呼吸”不同，這種代謝方式又稱”胞外呼吸”. 能夠進行上述方式進行呼吸代謝的微生物稱異化鐵還原菌. 馴化污泥不僅可以還原脫氯，還具有還原Fe(Ⅲ)的功能，且Fe(Ⅲ)的存在強化了系統(tǒng)的脫氯，因此馴化污泥中應富集了異化鐵還原菌的相關種屬. 當含氯有機物存在時，F(xiàn)e(Ⅲ)起到電子轉運的功能. 而提高Fe(Ⅲ)的電子轉運效率是強化還原脫氯的關鍵之一，因此深入研究異化鐵還原菌及在污泥中的地位、 功能對強化還原脫氯有重要的意義.
圖 4 馴化污泥還原Fe(Ⅲ)
圖 5 Fe(Ⅲ)對馴化污泥降解2,4,6-三氯酚影響
2.3.2 AQDS
由圖 6可見，乳酸鈉為電子供體AQDS為唯一電子受體時，馴化污泥可快速將AQDS還原為AH2QDS，24 h的還原率均可達到80%以上，而未經馴化的污泥AQDS還原能力有限，還原率均不到30%. 這進一步說明污泥中富集了一定數(shù)量的異化鐵還原微生物，并通過胞外電子傳遞的方式，以乳酸鈉為電子供體將電子傳遞給氧化態(tài)的AQDS，生成還原態(tài)的AH2QDS. 完成電子傳遞的是AQDS分子內的醌基，醌基接受氫后轉化為氫醌，因此這一過程又稱醌呼吸，醌呼吸是異化鐵還原菌代謝特性之一. 而同時添加AQDS和2,4,6-TCP時發(fā)現(xiàn)，AQDS明顯加快了2,4,6-TCP的脫氯，24 h降解率為90.4%，而對照樣為69.1%，見圖 7(10 mmol ·L-1、 5 mmol ·L-1 2，7-AQDS對HPCL出峰有干擾，數(shù)據未列出). AQDS不僅可在厭氧環(huán)境中充當有機物礦化的電子受體，而且可在異化鐵還原菌和可還原態(tài)物質(重金屬、 有機污染物、 染料等)之間充當電子穿梭體，促進這些物質的還原[33, 34]. 本研究進一步證明，AQDS可強化2,4,6-TCP還原脫氯，其原理可能是AQDS的介導作用加速了電子在微生物和有機氯之間的傳遞，目前尚無明確的結論，需進一步研究.
圖 6 馴化污泥還原轉化AQDS
圖 7 AQDS對馴化污泥降解2,4,6-三氯酚影響
馴化污泥可在不同的條件下由不同的脫氯機制主導，其中，一些微生物通過還原脫氯酶進行脫氯呼吸作用; 異化鐵還原菌在無電子介體時，進行直接脫氯作用. 當有電子介體時，則通過電子介體的介導作用，實現(xiàn)有機氯的還原. 電子介體為Fe(Ⅲ)時，部分微生物則同步進行異化鐵還原脫氯，為AQDS時，則進行醌呼吸脫氯，其本質均為胞外呼吸電子傳遞的代謝作用，且脫氯作用在電子介體的作用下得到強化，其電子傳遞途徑為： 有機物→異化鐵還原菌→電子介體→有機氯，污泥的脫氯途徑見圖 8. 因此，深入研究微生物之間相互聯(lián)系、 相互促進及介導機制等是今后亟待解決的問題.具體參見污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關技術文檔。
圖 8 馴化污泥還原脫氯途徑
3 結論
(1)厭氧條件下，以乳酸鈉為電子供體，2,4,6-TCP為電子受體馴化活性污泥，可實現(xiàn)2,4,6-TCP快速初始性降解，9-24 h內40-80 μmol ·L-1 TCP可100%轉化，中間產物有2,4-DCP，終產物主要為4-CP及苯酚.
(2)馴化污泥以脫鄰位氯降解菌為優(yōu)勢種群，可同時脫除2,4,6-TCP和2,4-DCP的鄰位氯，單獨降解4-CP和苯酚時，代謝速率慢，轉化率低，具有明顯的底物專一性.
(3)馴化污泥降解2,4,6-TCP殘留物經好氧污泥處理可實現(xiàn)快速徹底礦化，好氧條件下，殘留的4-CP(33 μmol ·L-1)2 h實現(xiàn)100%去除.
(4)馴化污泥可將Fe(Ⅲ)還原為Fe(Ⅱ)，并具有較強的腐殖質(AQDS)還原能力，說明馴化污泥富集了異化鐵還原菌.
(5)電子介體Fe(Ⅲ)和AQDS可強化2,4,6-TCP轉化速率，在電子介體的介導作用下，厭氧污泥可同時進行胞外呼吸實現(xiàn)脫氯.（來源及作者：上海師范大學生命與環(huán)境科學學院 宋佳秀 李玲 盛凡凡 郭翠香 張永明 李祖元 王天麗 ）
