高含固[進(jìn)料含固率(total solids，TS)>10%]厭氧消化是解決我國(guó)脫水污泥處理處置問題的重要途徑.相比傳統(tǒng)的低含固厭氧消化(含固率為1%~5%)[1]，高含固厭氧消化技術(shù)甚至可以直接利用污水處理廠的脫水污泥(含固率為20%)，因而具有設(shè)施體積小、水耗及能耗較低等優(yōu)勢(shì).另外，高含固厭氧消化系統(tǒng)和傳統(tǒng)的低含固厭氧消化系統(tǒng)相比，VS降解率基本相當(dāng)，而高含固厭氧消化系統(tǒng)的單位容積產(chǎn)氣率更高[2]，具有更好的應(yīng)用前景.

　　然而，由于污泥高含固厭氧消化系統(tǒng)的進(jìn)料中含氮物質(zhì)如蛋白質(zhì)、尿素等含量更高，經(jīng)過微生物的作用，它們會(huì)最終降解為小分子的氨氮并累積在系統(tǒng)中.過高的氨氮濃度會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用[3]，從而降低整個(gè)消化系統(tǒng)的產(chǎn)氣性能.總氨氮(TAN)又分為銨根離子和游離態(tài)的氨(FAN)，其中游離氨具有較高的細(xì)胞膜滲透性而被認(rèn)為是產(chǎn)生氨抑制的主要原因[4].微生物被氨氮抑制的可能機(jī)制是游離氨作為疏水性分子，通過被動(dòng)擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞，破壞了細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)子平衡并導(dǎo)致鉀的缺乏[5].另外，進(jìn)入細(xì)胞的游離氨在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)殇@，銨在細(xì)胞內(nèi)積累改變了細(xì)胞內(nèi)的pH，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[6].關(guān)于游離氨對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響，由于系統(tǒng)的含固率、基質(zhì)、溫度和接種泥馴化程度等各種因素的不同，所得出的游離氨抑制閾值也從幾十到幾百毫克升不等[7].例如，傳統(tǒng)的低含固厭氧消化系統(tǒng)中，F(xiàn)AN在145 mg·L-1，pH為7.43時(shí)便會(huì)使家禽糞便懸浮液厭氧消化的產(chǎn)氣量下降27%[8].在高含固厭氧消化系統(tǒng)中，Hidaka等[9]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FAN在不到600 mg·L-1的條件下，高含固系統(tǒng)COD降解率就受到明顯抑制.然而，微生物對(duì)于游離氨的耐受度可以更高，Kim等[10]發(fā)現(xiàn)FAN為700 mg·L-1時(shí)系統(tǒng)仍能穩(wěn)定運(yùn)行不受抑制.而Calli等[11]利用人工配水作為基質(zhì)，在提高游離氨的過程中，COD降解率一直維持在78%~96%，即使在FAN最終達(dá)到800 mg·L-1時(shí)依然維持在80%，系統(tǒng)性能并沒有受到抑制.所以，厭氧消化氨抑制研究的重點(diǎn)不僅在于獲得游離氨的抑制閾值濃度，還在于研究游離氨濃度改變背后相關(guān)的微生物種群結(jié)構(gòu)和代謝途徑的變化，從而真正揭示氨抑制的機(jī)制.游離氨的計(jì)算方法與總氨氮、pH和溫度有關(guān)，在溫度不變的情況下，環(huán)境中的pH值越低，F(xiàn)AN也越低.例如在厭氧消化溫度為37℃的條件下，當(dāng)pH從8.0降低至7.0時(shí)，F(xiàn)AN占TAN的比例將會(huì)從11%下降至1.2%，因而降低pH是一種降低系統(tǒng)中FAN濃度的方法.不同的微生物的適宜pH范圍也有所不同, 產(chǎn)甲烷菌的最適宜pH范圍為6.5~7.8[12]，而產(chǎn)酸菌最佳pH在5.5~7.0[3]，控制pH在微生物適宜的范圍內(nèi)可能可以減輕FAN的抑制作用[9].

　　本實(shí)驗(yàn)采用9 L的半連續(xù)厭氧消化裝置，以脫水污泥為原料，分別通過降低pH和人為投加氨氮的手段來降低和提高反應(yīng)器內(nèi)的游離氨濃度，以考察兩種調(diào)控手段下游離氨濃度的變化對(duì)厭氧消化系統(tǒng)性能的影響.與此同時(shí)，利用高通量測(cè)序和定量PCR的分析方法，研究高含固污泥厭氧消化系統(tǒng)在不同的游離氨調(diào)控策略下性能參數(shù)以及相應(yīng)的細(xì)菌和古菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化，以期為最終合理控制高含固厭氧消化體系中游離氨濃度，保證消化系統(tǒng)良好穩(wěn)定地運(yùn)行提供理論支撐.

　　1 材料與方法

　　1.1 厭氧消化實(shí)驗(yàn)

　　實(shí)驗(yàn)中的脫水污泥取自上海某污水處理廠的脫水污泥機(jī)房，脫水后的污泥含固率(TS)和揮發(fā)性固體(VS)占總固體比例(VS/TS)分別為20.1%和53.9%.實(shí)驗(yàn)所用接種污泥取自實(shí)驗(yàn)室中穩(wěn)定運(yùn)行的脫水污泥中溫厭氧消化反應(yīng)器，TS和VS/TS分別為13.2%和46.0%.進(jìn)料脫水污泥和接種泥的碳氮比(C/N)分別為6.9：1和5.2：1.

　　半連續(xù)式反應(yīng)器的有效容積為9 L，通過螺帶式攪拌裝置進(jìn)行攪拌，內(nèi)置的水浴溫控裝置能維持反應(yīng)器內(nèi)物料溫度為(37±1)℃.每日產(chǎn)氣量通過濕式氣體流量計(jì)測(cè)定.反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為60 r·min-1，以轉(zhuǎn)動(dòng)/停止為10 min/10 min方式交替運(yùn)行.運(yùn)行的首日向反應(yīng)器內(nèi)加入4 kg接種泥和1 kg基質(zhì)原泥，之后連續(xù)4 d每天添加1 kg事先通過自來水配制好的含固率為15%的脫水污泥至反應(yīng)體系的總體積達(dá)到9 L，從第6 d開始按照固體停留時(shí)間(solid retention time，SRT)為20 d以半連續(xù)方式進(jìn)出料(每天進(jìn)出料各一次).

　　本實(shí)驗(yàn)共運(yùn)行2臺(tái)反應(yīng)器(R1和R2). R1在穩(wěn)定運(yùn)行至35 d后每天將適量的濃HCl與進(jìn)料混合，在第50 d反應(yīng)器pH下降至7.09±0.02，隨后穩(wěn)定該pH值41 d，第92 d停止添加HCl直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束. R2在穩(wěn)定運(yùn)行至56 d后，開始在進(jìn)料中添加30 g NH4Cl，并依據(jù)TAN分析結(jié)果分別于第58 d和第67 d加入13 g和35 g NH4Cl以使得反應(yīng)器內(nèi)的TAN從3 284 mg·L-1增加到5 500 mg·L-1.從第70 d開始，為了維持TAN在5 000~6 000 mg·L-1，根據(jù)出料中氨氮的流失量計(jì)算，每天在進(jìn)料中加入5 g NH4Cl至實(shí)驗(yàn)結(jié)束. 70~124 d這一階段FAN從穩(wěn)定階段的(400±173) mg·L-1提高到了(526±25) mg·L-1.系統(tǒng)FAN濃度范圍最終穩(wěn)定在450~600 mg·L-1(總氨氮濃度為5 000~6 000 mg·L-1)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束.

　　1.2 指標(biāo)分析方法

　　平均每周采集兩次反應(yīng)器的出料進(jìn)行分析，測(cè)定pH、TS、VS/TS，揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)濃度、總堿度、總氨氮(TAN)濃度、氣體成分.每天記錄產(chǎn)氣量. pH測(cè)定采用實(shí)驗(yàn)室用pH計(jì)(S210, METTLER, Switzerland).消化污泥樣品在13 000 r·min-1下離心20 min后進(jìn)行過濾，濾液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾后，稀釋一定倍數(shù)并加入甲酸調(diào)整pH≤2.0，再使用氣相色譜[2010 plus, Shimadzu, Japan，火焰離子化檢測(cè)器(FID)]測(cè)定VFA濃度.所使用的色譜柱為Rtx-WAX型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm). TS、VS/TS、總堿度和TAN濃度采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)得[13].沼氣中甲烷和二氧化碳的含量測(cè)定采用裝有熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)的氣相色譜儀(GC112A, INESA, China)，色譜柱為GDX-102(2 m×4 mm).游離氨濃度根據(jù)總氨氮濃度、pH和溫度計(jì)算得到[14], 具體計(jì)算公式如下：

　　(1)

　　式中，[FAN]和[TAN]分別為游離氨和總氨氮的濃度(mg·L-1);T為熱力學(xué)溫度(K).

　　VS降解率(VSreduction)由式(2)[15]計(jì)算得出(假定系統(tǒng)中無機(jī)組分，即不能被降解的物質(zhì)的量保持恒定)：

　　(2)

　　式中, VSdigestate和VSfeed分別為厭氧消化后的沼渣和進(jìn)料污泥中的VS占TS的比例(VS/TS，%).

　　1.3 微生物分析

　　1.3.1 微生物種群結(jié)構(gòu)分析

　　定期保留反應(yīng)器出料于2 mL凍存管中，于-80℃冷凍保存. DNA樣品使用土壤DNA提取試劑盒(PowerSoil，MO BIO, USA)提取.分析中選用的8個(gè)R1樣品來自第28、35、42、49、77、88、109和124 d，代表了穩(wěn)定、調(diào)控、抑制穩(wěn)定和恢復(fù)這4個(gè)階段.所選用的16個(gè)R2樣品來自第4、10、16、21、28、35、42、49、56、58、63、70、77、84、91和102 d，代表了R2啟動(dòng)、穩(wěn)定、提高游離氨、高游離氨抑制穩(wěn)定這4個(gè)階段.提取出的DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增，采用高通量測(cè)序(MiSeq4000, Illumina)分析其中古菌與細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu). PCR產(chǎn)物先利用QuantiFLuorTM系統(tǒng)(Promega)測(cè)定濃度，隨后依據(jù)AxyPrep DNA試劑盒(AXYGEN, USA)的凝膠回收的方法進(jìn)行提純.提純的PCR產(chǎn)物的質(zhì)量通過凝膠電泳確定.引物設(shè)計(jì)根據(jù)Illumina公司(San Diego, California, USA)的操作手冊(cè)，針對(duì)細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因的通用擴(kuò)增引物對(duì)分別為338f (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)/806r (5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[16]和344f (5′-ACGGG GYGCAGCAGGCGCGA-3′)/915r (5′-GTGCTCCCCC GCCAATTCCT-3′)[17].

　　1.3.2 甲烷菌定量PCR分析

　　本研究中根據(jù)多樣性分析結(jié)果，選取產(chǎn)甲烷菌中主要菌群甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)，對(duì)其16S rRNA基因濃度變化進(jìn)行了定量分析.定量PCR實(shí)驗(yàn)采用Sybergreen熒光染料法，引物設(shè)計(jì)采用甲烷八疊球菌科16S rRNA基因的特異引物對(duì)：前引物(5′-GAAACCGYGATAAGGGGA-3′)和后引物(5′-TAGCGARCATCGTTTACG-3′)[18].使用定量PCR儀(7500 Real Time PCR System，Applied Biosystems)對(duì)Methanosarcinaceae進(jìn)行定量分析. Sybergreen定量PCR反應(yīng)體系為10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus) (2x) (TaKaRa, Japan), 0.8 μL前引物(10 μmol·L-1), 0.8 μL后引物(10 μmol·L-1), 0.4 μL ROXⅡ，2 μL模板DNA和PCR等級(jí)無菌水，最終體積為20 μL.每個(gè)樣品3個(gè)平行.反應(yīng)步驟：先95℃下預(yù)變性30 s，然后經(jīng)過95℃下5 s, 55℃下30 s和72℃下40 s循環(huán)40次.每一次循環(huán)的最后一個(gè)步驟檢測(cè)熒光值.

　　2 結(jié)果與討論2.1 游離氨調(diào)控對(duì)系統(tǒng)性能的影響2.1.1 降低游離氨濃度對(duì)產(chǎn)氣量和VS降解率的影響

　　R1的相關(guān)理化指標(biāo)變化曲線如圖 1所示.在反應(yīng)器啟動(dòng)階段(0~24 d)，日產(chǎn)氣量波動(dòng)較大，并且在第13 d和第24 d出現(xiàn)兩個(gè)產(chǎn)氣高峰.該階段有大量的VFA積累，TAN含量也很高，說明啟動(dòng)階段水解和產(chǎn)酸菌活性相對(duì)于產(chǎn)甲烷菌活性更高，能夠快速降解大量的大分子有機(jī)物并生成VFA，而此時(shí)產(chǎn)甲烷菌由于其世代周期相對(duì)較長(zhǎng)，還不能大量增殖并及時(shí)消耗乙酸，導(dǎo)致VFA積累和產(chǎn)氣劇烈波動(dòng). 25 d后，R1的產(chǎn)氣量逐漸穩(wěn)定，pH也穩(wěn)定在7.98±0.04，穩(wěn)定階段(25~35 d) FAN約為(329±40) mg·L-1. Braun等[19]利用液態(tài)的豬糞進(jìn)行厭氧發(fā)酵，提出FAN在150 mg·L-1時(shí)系統(tǒng)就開始受到抑制，他們的反應(yīng)系統(tǒng)在降低pH之后獲得了更好的產(chǎn)氣量.同樣，Zeeman等[20]在牛糞的高溫厭氧消化過程中，TAN為3 000 mg·L-1，發(fā)現(xiàn)在pH為7.5時(shí)，性能很差，而當(dāng)他們將pH降到7.0后，由于FAN的降低，甲烷的產(chǎn)量增長(zhǎng)了4倍.因此，為了使得游離氨濃度下降，減輕微生物所受的游離氨的抑制作用，獲得更好的產(chǎn)氣性能，從第35 d開始人為地向R1中添加HCl，使得pH逐漸下降并在50 d之后穩(wěn)定在7.09±0.02.盡管FAN在50~91 d從之前的(329±40) mg·L-1下降到了(47±13) mg·L-1，但是這個(gè)階段的日產(chǎn)氣量平均為(10.8±0.3) L·d-1，相比穩(wěn)定階段的(14.4±1.1) L·d-1卻減少了25%.由表 1可知，VS降解率也和日產(chǎn)氣量相似，隨著游離氨濃度下降而降低，并未出現(xiàn)與之前的研究[19, 20]相一致的結(jié)果.在第91 d停止添加HCl之后，pH和FAN逐漸恢復(fù)到厭氧消化的初始范圍，VS降解率和日產(chǎn)氣量也隨之上升.可見，在本實(shí)驗(yàn)的高含固厭氧消化系統(tǒng)中，降低pH雖然明顯降低了FAN的濃度，但是并沒有達(dá)到預(yù)期的減輕游離氨對(duì)微生物的毒害作用進(jìn)而提升系統(tǒng)產(chǎn)氣性能的目的.相反，從pH下降和回升的兩個(gè)階段的數(shù)據(jù)都可看出，pH的降低明顯影響了系統(tǒng)有機(jī)物的水解率和VS降解率，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷菌的底物供給不足，最終引起產(chǎn)氣量的下降.

　　圖 1 R1的性能參數(shù)隨時(shí)間的變化曲線

　　表 1 R1在不同階段的各項(xiàng)指標(biāo)(置信區(qū)間95%)

　　2.1.2 提高游離氨濃度對(duì)產(chǎn)氣量和VS降解率的影響

　　與R1反應(yīng)器不同，R2是通過提高TAN的濃度來調(diào)控FAN的濃度.由圖 2可知，R2在啟動(dòng)階段(0~39 d)和R1相似，產(chǎn)氣量波動(dòng)較大，在第15 d和第26 d分別出現(xiàn)產(chǎn)氣高峰. R2在40 d之后達(dá)到穩(wěn)定，穩(wěn)定階段(40~56 d)日產(chǎn)氣量為(12.0±0.3) L·d-1，VS降解率為(34.1±1.1)%，甲烷含量約為64.8%，各項(xiàng)性能參數(shù)與之前穩(wěn)定運(yùn)行的污泥高含固厭氧消化反應(yīng)器接近[21].由圖 2和表 2可知，隨著FAN的提升，日產(chǎn)氣量和VS降解率都出現(xiàn)了明顯下降，相比穩(wěn)定階段分別減少了14.2%和33.7%.雖然外加氨氮之后，由于NH4Cl與污泥中的OH-能進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致在提升氨氮初期H+濃度增加，pH有所下降.但是，pH的變化幅度較小，70 d以后系統(tǒng)pH又逐漸恢復(fù)，盡管游離氨濃度超過500 mg·L-1，但消化系統(tǒng)仍然能保持穩(wěn)定運(yùn)行，說明系統(tǒng)處于“抑制的穩(wěn)定狀態(tài)”[3].

　　圖 2 R2的性能參數(shù)隨時(shí)間的變化曲線

　　表 2 R2在不同階段的各項(xiàng)指標(biāo)(置信區(qū)間95%)

　　2.2 游離氨調(diào)控對(duì)細(xì)菌種群的影響

　　當(dāng)通過降低pH的方式來降低R1系統(tǒng)中游離氨濃度時(shí)，細(xì)菌種群的變化如圖 3所示.從中可知，Candidate_division_WS 6 _norank在恢復(fù)階段含量明顯提高.然而，已有研究中尚未記載這種細(xì)菌的具體功能，因而也無法判斷其在系統(tǒng)中所起的作用.

　　圖 3 R1中細(xì)菌相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化

　　另一方面，在前兩個(gè)階段中，相對(duì)豐度占前幾位的分別為OPB 54 _norank(14%~26%)、Proteiniphilum(7%~11.7%)、Family_XIV_uncultured(5%~13%)和D8A-2_norank(1%~3.9%，其中第49 d占13.2%)，在抑制穩(wěn)定階段這些微生物的相對(duì)豐度全部都下降到5%以下，顯然隨著pH條件的改變，這些細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝受到了影響. Proteiniphilum是一種產(chǎn)酸菌，主要產(chǎn)物是乙酸和丙酸，能夠進(jìn)行解朊作用降解蛋白質(zhì)并產(chǎn)生NH3[22].本實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)豐度隨pH下降幅度最大的細(xì)菌是OPB54 _norank. Hao等[23]利用乙酸為基質(zhì)進(jìn)行高溫厭氧消化，并設(shè)置了低TAN (2 600 mg·L-1)和高TAN (7 000 mg·L-1)兩組實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)OPB54(具體功能未知)在兩種氨氮濃度下均是含量最多的細(xì)菌，但是在低FAN下相對(duì)豐度更高，這與本研究的結(jié)果并不一致.除此之外，一些第一階段含量較少的細(xì)菌如Tepidimicrobium(3.9%)、Macellibacteroides(1.8%)、Caldicoprobacter(1.5%)也都隨著pH調(diào)控游離氨下降而種群豐度明顯降低. Tepidimicrobium能分解葡萄糖等多種糖類，也可以降解蛋白類的物質(zhì)，產(chǎn)物為乙酸、乙醇、H2和CO2等，有研究表明Tepidimicrobium最適宜的pH范圍是8~8.5[24, 25]，本實(shí)驗(yàn)中pH降低到7.1可能會(huì)是抑制該菌屬生長(zhǎng)的一個(gè)原因.同樣情況下，由于Macellibacteroides和Caldicoprobacter是能分解糖類的細(xì)菌，他們的最終代謝產(chǎn)物也為小分子的VFA、H2和CO2等[26, 27]，這兩類細(xì)菌豐度的下降也在一定程度上解釋了有機(jī)物含量升高的原因.由此可見，通過pH調(diào)控游離氨濃度使得系統(tǒng)理化環(huán)境不適宜于原本一些豐度較大的降解糖類和蛋白的產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)，從而使得VS降解率下降.

　　由圖 3可知，隨著pH的調(diào)控，在抑制穩(wěn)定階段，理研菌屬(Rikenellaceae_RC9 _gut_group)和Family_XIV_uncultured的相對(duì)豐度從之前的不足1%分別上升至24.3%和22.9%，Petrimonas和Acholeplasma也從不足1%分別增長(zhǎng)到1.1%和4.9%.這其中，理研菌屬Rikenellaceae不僅可以分解碳水化合物而且還可以降解蛋白質(zhì)[28].而值得注意的是，隨著游離氨濃度的上升恢復(fù)，這些微生物種群相對(duì)數(shù)量又明顯下降，比如Rikenellaceae_RC9 _gut_group相對(duì)豐度又迅速下降到1%以下，F(xiàn)amily_XIV_uncultured也降低至2.8%.有研究表明上述這些菌屬雖然也都是進(jìn)行糖類降解的產(chǎn)酸菌[29, 30]，但從結(jié)果來看其代謝能力與Tepidimicrobium、Macellibacteroides和Caldicoprobacter相比明顯較弱.互營(yíng)單胞菌屬Syntrophomonas的種群豐度在抑制穩(wěn)定階段也有明顯增長(zhǎng)，但在恢復(fù)階段并沒有下降，表明了這類微生物良好的pH適應(yīng)范圍.互營(yíng)單胞菌屬Syntrophomonas是一種互養(yǎng)型的具有氧化一些重要的中間產(chǎn)物如丙酸和丁酸的功能的細(xì)菌，代謝產(chǎn)物為乙酸和H2，該細(xì)菌必須要和能夠消耗H2的微生物共同培養(yǎng)才能夠生長(zhǎng)[31]，屬于互養(yǎng)型的降解途徑. Syntrophomonas在FAN升高時(shí)會(huì)受到抑制，在研究不同的工程規(guī)模[32]或者實(shí)驗(yàn)室規(guī)模[33]的厭氧反應(yīng)器中的微生物種群結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)高游離氨濃度的反應(yīng)器里例如Syntrophomonas、Pelotomaculum、Desulfobulbus等互養(yǎng)型微生物較低游離氨的反應(yīng)器含量更少，顯示互養(yǎng)型代謝更易受到游離氨的抑制.當(dāng)為了降低游離氨濃度而控制pH值至7.0之后，系統(tǒng)中承擔(dān)糖類和蛋白的降解的微生物類型發(fā)生了轉(zhuǎn)化，之前豐度較大的該類細(xì)菌種群相對(duì)數(shù)量都出現(xiàn)降低，而另一些之前豐度較小的細(xì)菌含量增加，與此同時(shí)反應(yīng)器的有機(jī)物降解性能和產(chǎn)氣性能出現(xiàn)下降.

　　而當(dāng)通過外加氨氮提高R2系統(tǒng)中游離氨濃度時(shí)，細(xì)菌種群的變化如圖 4所示, R2反應(yīng)器中3種主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群，在啟動(dòng)階段，Tepidimicrobium和Proteiniborus的相對(duì)豐度分別在第21 d和第16 d達(dá)到各自的最高值33.8%和15.8%.而后，兩種細(xì)菌都在35 d下降，分別為18.3%和6.2%.細(xì)菌種群的豐度在穩(wěn)定階段保持基本不變，除了Anaerobranca在第42 d有一個(gè)激增.當(dāng)?shù)?6 d開始，隨著R2內(nèi)游離氨濃度的不斷上升，Anaerobranca也出現(xiàn)了明顯的隨之上升的趨勢(shì)，而Tepidimicrobium和Proteiniborus則表現(xiàn)出隨著FAN上升而降低的趨勢(shì). Tepidimicrobium是一種解胨型的細(xì)菌，可以以多種蛋白質(zhì)的物質(zhì)為基質(zhì)來維持自己的生長(zhǎng)[25]，在R1和R2兩組實(shí)驗(yàn)中，都發(fā)現(xiàn)了Tepidimicrobium的相對(duì)豐度隨著游離氨的變化明顯地改變，即不論是游離氨濃度提高還是降低，Tepidimicrobium的豐度都有所下降.和Tepidimicrobium類似，Proteiniborus也可以在pH值6~8的范圍里利用蛋白質(zhì)作為發(fā)酵底物[34]. Anaerobranca本質(zhì)上也是分解蛋白質(zhì)的細(xì)菌[35]. Prowe等[36]發(fā)現(xiàn)Anaerobranca只包含幾種可以厭氧發(fā)酵蛋白轉(zhuǎn)化為乙酸的厭氧微生物.本實(shí)驗(yàn)中第42 d Anaerobranca的增多同時(shí)也伴隨著游離氨濃度的上升，可以看出當(dāng)游離氨濃度變高的時(shí)候，Anaerobranca在整個(gè)蛋白的分解過程中所起的作用更大.而Anaerobranca對(duì)蛋白質(zhì)的降解速率可能小于Tepidimicrobium和Proteiniborus，從而導(dǎo)致系統(tǒng)VS降解率的下降.

　　圖 4 R2中3種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化

　　2.3 游離氨調(diào)控對(duì)產(chǎn)甲烷菌種群的影響

　　由圖 5可知，R1反應(yīng)器中游離氨濃度下降之后，氫利用型的甲烷囊菌屬(Methanoculleus)的相對(duì)豐度明顯降低，從13%下降到1.9%，并且在恢復(fù)階段也未能完全恢復(fù)至原有水平，繼續(xù)下降至不足1%.而整個(gè)過程中，乙酸型的甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)相對(duì)豐度一直大于80%，在與甲烷囊菌屬的競(jìng)爭(zhēng)中，隨著游離氨濃度和pH的下降，逐漸占據(jù)了更大的優(yōu)勢(shì)，最后豐度甚至達(dá)到97%.但是因?yàn)橄到y(tǒng)的產(chǎn)氣量和VS降解率隨著FAN和pH的下降而降低，為了更準(zhǔn)確地觀察游離氨及pH對(duì)產(chǎn)甲烷菌種群尤其是甲烷八疊球菌(Methanosarcina)的影響，通過定量PCR的分析而獲得其16S rRNA基因濃度的變化趨勢(shì)來定量分析甲烷菌種群的動(dòng)態(tài)變化.由圖 6知，R1反應(yīng)器內(nèi)相對(duì)豐度最大的甲烷八疊球菌的16S rRNA基因濃度(以濕泥計(jì)，下同)在第28 d和35 d分別為(1.27×106±8.0×104) copies·g-1和(1.19×106±9.89×104) copies·g-1，之后盡管pH不斷降低，但依然維持在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)，波動(dòng)變化不大.而到了第88 d 16S rRNA基因濃度明顯下降，為(1.27×105±1.22×104) copies·g-1，這時(shí)系統(tǒng)pH值已經(jīng)在7.1維持了38 d，約2個(gè)SRT，顯然之前pH為7左右的長(zhǎng)時(shí)間作用已經(jīng)使得較多的甲烷八疊球菌受到底物持續(xù)供給不足的影響.之后隨著FAN和pH的回升，甲烷八疊球菌16S rRNA基因濃度又回升至106 copies·g-1的數(shù)量級(jí)水平.可見產(chǎn)甲烷菌種群在通過pH調(diào)控游離氨的過程中由于細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的影響而受到基質(zhì)供給不足的抑制，但隨著pH的回升又較快恢復(fù)了活性.

　　圖 5 R1的古菌在屬的水平上隨時(shí)間的變化

　　圖 6 R1甲烷八疊球菌數(shù)量隨時(shí)間的變化(n=3)

　　R2樣品的古菌多樣性分析結(jié)果如圖 7所示，乙酸型的甲烷八疊球菌Methanosarcina為優(yōu)勢(shì)種群，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中占古菌的比例一直在92%以上，說明甲烷八疊球菌可能并沒有受到游離氨濃度提高的抑制.定量PCR的結(jié)果也表明在游離氨濃度從(400±173) mg·L-1提高到(526±25) mg·L-1之后，R2內(nèi)的甲烷八疊球菌的16S rRNA基因平均濃度從(3.43×106±2.91×106) copies·g-1變化為(3.58×106±1.18×106) copies·g-1，數(shù)量基本相同.因而，有機(jī)物降解受到抑制的主要原因應(yīng)該來源于細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)所受的影響[37].具體參見污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 7 R2的古菌在屬的水平上隨時(shí)間的變化

　　3 結(jié)論

　　(1)當(dāng)FAN從(400±173) mg·L-1提高到(526±25) mg·L-1后，相比正常的消化狀態(tài)，系統(tǒng)的日產(chǎn)氣量和VS降解率分別降低了14.2%和33.7%，但依然能在抑制的狀態(tài)下穩(wěn)定運(yùn)行.

　　(2)當(dāng)通過pH調(diào)控使得FAN從(330±99) mg·L-1下降至(47±13) mg·L-1，系統(tǒng)的日產(chǎn)氣量和VS降解率分別降低了25%和26.9%，而隨著pH和FAN恢復(fù)至正常水平，系統(tǒng)的產(chǎn)氣性能和VS降解率又恢復(fù)至原有水平，相比抑制穩(wěn)定階段分別提高了9.3%和31.6%.

　　(3)本文中的兩種游離氨調(diào)控方式都會(huì)影響污泥高含固厭氧消化系統(tǒng)中細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu).投加外來氨氮后，過高的FAN (500~600 mg·L-1)會(huì)使得降解蛋白的細(xì)菌種類朝著蛋白降解率更低的細(xì)菌菌群轉(zhuǎn)變，但并沒有影響到主要的產(chǎn)甲烷菌(甲烷八疊球菌)的生長(zhǎng);另一方面，通過降低pH來降低游離氨的濃度并不一定能使得性能提高，反而可能會(huì)由于pH的變化影響一些的糖類和蛋白質(zhì)類發(fā)酵細(xì)菌的活性，導(dǎo)致水解效率的下降，引發(fā)后續(xù)產(chǎn)甲烷菌的底物供給不足，削弱系統(tǒng)產(chǎn)氣性能.(來源及作者：同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 戴曉虎、何進(jìn)、嚴(yán)寒、李寧、丁月玲、董濱、戴翎翎)