1 引言(Introduction)

　　直接染料是一類能夠直接讓纖維及其他物質(zhì)著色的染料，也是最為常見的染料種類之一。但在直接染料使用過程中約有10%的染料被排放到水中，造成嚴(yán)重的水環(huán)境污染。另外，由于直接染料具有較強(qiáng)的親水性，導(dǎo)致直接染料廢水很難達(dá)到較好的處理效果，因此，研究直接染料廢水處理技術(shù)對(duì)于未來直接染料的持續(xù)應(yīng)用具有重要的意義.

　　目前，針對(duì)染料廢水的處置方法主要包括物理、化學(xué)和生物法。其中，物理和化學(xué)法雖然具有較好的脫色效果，但存在COD去除率低、成本高、產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了染料廢水處理技術(shù)的推廣和應(yīng)用。而生物法處理染料廢水具有持續(xù)性降解、環(huán)境友好且對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的二次污染更小等特點(diǎn)。目前在染料廢水治理方面應(yīng)用較多的微生物主要包括細(xì)菌、白腐真菌、放線菌和藻類等.其中，白腐真菌憑借其廣譜、高效、低耗、適用性強(qiáng)的生物降解能力，對(duì)多種結(jié)構(gòu)的染料具有明顯的脫色能力。自20世紀(jì)80年代初，Glenn和Gold首次發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)可以對(duì)部分聚合染料脫色降解以來，人們陸續(xù)開展了P. chrysosporium對(duì)偶氮、蒽醌、三苯甲烷等不同類型染料降解的研究。近年來，具有脫色能力的白腐真菌被不斷挖掘，如彩絨革蓋菌(Coriolus versicolor)、變色栓菌(Trametes versicolr)、靈芝(Ganoderma sp.)、粗皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)、一色齒毛菌(Cerrena unicolor)等。目前，人們對(duì)白腐真菌降解染料的研究已經(jīng)深入到分子水平，對(duì)其降解機(jī)理有了一定的了解.但由于白腐真菌發(fā)揮降解功能受碳源、氮源、pH、金屬離子、鹽度、溫度等因素的影響，因此，白腐真菌在染料廢水治理方面的工業(yè)化應(yīng)用仍存在著諸多問題需要解決.

　　因此，本研究以直接大紅染料為研究對(duì)象，在進(jìn)行菌株CB1鑒定的基礎(chǔ)上，采用單因素及正交試驗(yàn)探究菌株CB1脫色直接大紅染料的優(yōu)化條件，以期為菌株CB1在直接染料廢水治理方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 材料2.1.1 供試菌株

　　菌株CB1由本實(shí)驗(yàn)室人員分離于野外朽木上，菌絲體保存于貴州大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室.

　　2.1.2 染料

　　直接黑CT、直接金黃2GT、直接大紅4BS、直接嫩黃5GL、直接蘭B2RL等染料及其他化學(xué)試劑均購自上海生物工程技術(shù)有限公司.

　　2.1.3 培養(yǎng)基

　　PDA培養(yǎng)基：稱取去皮新鮮馬鈴薯200 g，加入適量水煮沸20 min后，用4層紗布過濾，取濾液依次加入葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然;PDB培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基制作過程中不加入瓊脂粉所得液體發(fā)酵液;染料發(fā)酵液：PDB培養(yǎng)基制作過程中向培養(yǎng)基中加入直接大紅染料，使染料終濃度為50 mg·L-1.

　　2.1.4 試劑盒

　　DNAquick快捷型植物基因組非離心柱型試劑盒(TIANGEN).

　　2.2 方法2.2.1 菌株CB1的鑒定

　　挑取PDA斜面菌株CB1的菌絲接種于PDA平皿中央，28 ℃下暗培養(yǎng)7 d，分別于接種后的第1、3、5、7 d觀察菌絲生長(zhǎng)狀況及顏色變化等.同時(shí)于第7 d，挑取培養(yǎng)皿中尖端菌絲進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)的觀察，完成菌株的形態(tài)學(xué)鑒定;刮取5皿新活化的菌株CB1菌絲，利用DNAquick快捷型植物基因組非離心柱型試劑盒(TIANGEN)提取菌株CB1的基因組DNA.以基因組DNA為模板，利用ITS1和ITS4真菌通用引物擴(kuò)增菌株CB1的ITS序列.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后送上海生物工程有限公司測(cè)序，序列校正無誤后，提交至NCBI的Genbank，并將該序列與Blast比對(duì)結(jié)果中的序列進(jìn)行比對(duì)分析.同時(shí)選取一株偏腫栓菌(Trametes gibbosa)的ITS序列作為外源基因，利用Clust2.0進(jìn)行序列比對(duì)分析，利用MEGA5.0軟件的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

　　2.2.2 菌株CB1對(duì)5種直接染料的脫色

　　在PDA培養(yǎng)基制作的過程中，向培養(yǎng)基中分別加入直接黑CT、直接金黃2GT、直接大紅4BS、直接嫩黃5GL、直接蘭B2RL染料，使染料終濃度為50 mg·L-1.培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高溫高壓滅菌后，無菌條件下制作PDA平皿.截取直徑8 mm新活化菌株CB1的菌絲塊于平皿中央，28 ℃下暗培養(yǎng)10 d后，觀察平皿脫色情況，以不接入菌絲、含相同濃度染料的PDA平皿作為對(duì)照.

　　2.2.3 菌株CB1對(duì)直接大紅染料脫色的單因素優(yōu)化

　　碳源和氮源種類對(duì)菌株CB1脫色直接大紅的影響：在染料發(fā)酵液制作過程中分別以20 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源，分別向染料發(fā)酵液中加入1 g·L-1的硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨作為氮源，分別取上述40 mL發(fā)酵液加入到100 mL三角瓶中，121 ℃高溫高壓滅菌后，分別向三角瓶中轉(zhuǎn)入直徑8 mm新活化的菌株CB1菌絲塊3片，于28 ℃暗培養(yǎng)9 d;以染料發(fā)酵液中接入直徑8 mm新活化的菌株CB1菌絲塊3片作為對(duì)照，分別在第1~9 d測(cè)量吸光值，計(jì)算對(duì)應(yīng)處理的染料脫色率.

　　pH對(duì)菌株CB1脫色直接大紅的影響：在100 mL三角瓶中加入染料發(fā)酵液，分別調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH為3、5、7、9、11，經(jīng)121 ℃滅菌后，向三角瓶中接入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養(yǎng)9 d，以pH自然，含有等量染料的發(fā)酵液作為對(duì)照，分別在第1~9 d測(cè)量吸光值，計(jì)算對(duì)應(yīng)處理的染料脫色率.

　　金屬離子對(duì)菌株CB1脫色直接大紅的影響：在100 mL三角瓶中加入40 mL染料發(fā)酵液，分別向三角瓶中加入1 mmol·L-1的CuSO4、MnSO4、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeCl3，經(jīng)121 ℃滅菌后，向三角瓶中接入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養(yǎng)9 d;以染料發(fā)酵液接入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片作為對(duì)照，分別在第1~9 d測(cè)量吸光值，計(jì)算對(duì)應(yīng)的染料脫色率.

　　2.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株CB1對(duì)直接大紅的脫色

　　在單因素試驗(yàn)得出的較優(yōu)pH條件下，選擇較優(yōu)碳源(A)、氮源(B)、金屬1離子濃度(C)和金屬2離子濃度(D)設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素和水平見表 1.在100 mL三角瓶中加入40 mL染料發(fā)酵液，按L9(34)的正交表調(diào)整培養(yǎng)基中碳源濃度、氮源濃度和2種金屬離子濃度進(jìn)行9個(gè)不同處理的脫色試驗(yàn)，發(fā)酵液經(jīng)121 ℃高溫高壓滅菌后，向三角瓶中加入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養(yǎng)9 d，分別在第1~9 d測(cè)量吸光值，計(jì)算對(duì)應(yīng)處理的染料脫色率.

　　表 1 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株CB1脫色直接大紅染料的因素水平

　　2.2.5 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證

　　在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按正交試驗(yàn)最優(yōu)條件配置含有50 mg·L-1直接大紅染料的PDB液體培養(yǎng)基，121 ℃高溫高壓滅菌后，向三角瓶中加入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養(yǎng)9 d，分別在第1~7 d測(cè)量吸光值，計(jì)算對(duì)應(yīng)的染料脫色率.

　　2.2.6 染料吸光值的測(cè)定及脫色率的計(jì)算

　　在菌株CB1液體發(fā)酵的過程中，分別于培養(yǎng)第1、2、3、4、5、6、7、8、9 d吸取1.2 mL發(fā)酵液，10000 r·min-1離心5 min，吸取上層發(fā)酵液1 mL，于直接大紅4BS染料最大吸收波長(zhǎng)λmax=495 nm下測(cè)定染料吸光值，以相同處理?xiàng)l件下不接菌的染料發(fā)酵液作為對(duì)照.測(cè)得對(duì)照吸光值為L(zhǎng)0，不同時(shí)間處理吸光值為L(zhǎng)t，則染料脫色率R=(L0-Lt)/L0×100%.

　　3 結(jié)果與分析(Results and analysis)3.1 菌株CB1的鑒定

　　菌株CB1生長(zhǎng)很快，28 ℃下暗培養(yǎng)7 d后可鋪滿平皿(直徑9 cm)，培養(yǎng)基無明顯顏色變化;菌絲緊貼于瓊脂培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，成絨毛狀白色菌落，表面平滑;平皿邊緣菌絲為升起的羊毛狀(圖 1a)，這與由慶和何艷喜對(duì)變色栓菌(Trametes versicolor)的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相類似(何艷喜，2010; 由慶，2016).菌株CB1的ITS序列擴(kuò)增得到一長(zhǎng)度為643 bp的序列，該序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的Genbank號(hào)為KY949632.菌株CB1 ITS序列Blast比對(duì)的前100條結(jié)果中，該序列與Genbank號(hào)為AB811868.1和KJ528276.1的T. versicolor的ITS序列相似性高達(dá)100%，與Genbank號(hào)為AB811857.1、KC176306.1、FJ810146.1等70余株T. versicolor不同菌株的ITS序列相似性達(dá)99%.選取菌株CB1的ITS序列及其Blast比對(duì)結(jié)果中部分序列及一株T. gibbosa ITS序列共同構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖 2.由圖可知，菌株CB1與不同菌株來源的T. versicolor的ITS序列構(gòu)成一個(gè)分支，分支內(nèi)親緣關(guān)系較近，而T. gibbosa的ITS序列單獨(dú)作為一個(gè)分支，與菌株CB1及T. versicolor的ITS親緣關(guān)系較遠(yuǎn).因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果，將菌株CB1鑒定為變色栓菌，命名為Trametes versicolor CB1.

　　圖 1菌株CB1形態(tài)學(xué)鑒定(a.菌株CB1菌落正面;b.菌株CB1菌落反面;c.菌株CB1菌絲顯微結(jié)構(gòu)，箭頭指向?yàn)樗鳡盥?lián)合)

　　圖 2菌株CB1 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

　　3.2 T. versicolor CB1對(duì)5種直接染料的脫色

　　固體條件下，T. versicolor CB1對(duì)5種直接染料脫色10 d后的結(jié)果見圖 3.由圖可知，T. versicolor CB1對(duì)直接黑CT、直接金黃2GT、直接大紅4BS、直接嫩黃5GL、直接蘭B2RL 5種直接染料均有脫色能力.肉眼觀察平皿顏色變化可發(fā)現(xiàn)，T. versicolor CB1對(duì)直接大紅染料的脫色效果相對(duì)更明顯，故在接下來的試驗(yàn)中以直接大紅染料為研究對(duì)象，進(jìn)行T. versicolor CB1對(duì)直接大紅染料脫色條件的優(yōu)化.

　　圖 3菌株CB1對(duì)5種直接染料的固體脫色

　　3.3 碳源和氮源種類對(duì)T. versicolor CB1脫色直接大紅的影響

　　不同碳源、氮源條件下，T. versicolor CB1對(duì)直接大紅染料的脫色結(jié)果見圖 4.由圖 4a可知，與不添加碳源相比，幾種碳源的添加均利于T. versicolor CB1對(duì)直接大紅染料的脫色.其中，果糖與可溶性淀粉作為碳源的脫色效果更好，蔗糖、麥芽糖、葡萄糖作為碳源條件下的脫色效果依次減弱.由圖 4b可知，與不添加氮源相比，添加蛋白胨、氯化銨、尿素作為氮源的脫色率反而更低，添加硫酸銨作為氮源與不填加氮源的脫色率相近，而硝酸銨作為氮源條件下的脫色率高于不添加氮源條件下的脫色率.由此確定最佳碳源為果糖，最佳氮源為硝酸銨.方差分析結(jié)果顯示，Sig.值 < 0.05，表明不同碳源和不同氮源對(duì)T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響均顯著.

　　圖 4碳源(a)和氮源(b)種類對(duì)菌株CB1脫色直接大紅的影響

　　3.4 pH對(duì)T. versicolor CB1脫色直接大紅的影響

　　不同pH條件下菌株CB1對(duì)直接大紅9 d內(nèi)的脫色效果見圖 5.由圖可知，與pH自然條件下的脫色率相比，pH=9、11、3條件下的脫色率相對(duì)較低且依次減弱.而pH=7和pH=5條件下的脫色率均高于pH自然條件下的脫色率，且pH=5更利于菌株對(duì)直接大紅的脫色.由此可知，過酸和過堿的條件均不利于菌株CB1對(duì)直接大紅的脫色，而中性偏酸的條件更適合菌株CB1對(duì)直接大紅的脫色.方差分析結(jié)果顯示，Sig.值 < 0.05，表明pH對(duì)T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響顯著.

　　圖 5 pH對(duì)菌株CB1脫色直接大紅的影響

　　3.5 金屬離子對(duì)T. versicolor CB1脫色直接大紅的影響

　　添加不同金屬離子條件下菌株CB1對(duì)直接大紅9 d內(nèi)的脫色率變化見圖 6.由圖可知，添加ZnSO4、MgSO4、MnSO4條件下的脫色率均低于對(duì)照條件下的脫色率，且脫色率依次減弱.而添加FeCl3、CaCl2、CuSO4條件下的脫色率總體高于對(duì)照條件下的脫色率，且脫色率依次增高.故選擇CuSO4和CaCl2兩種金屬離子濃度作為2個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn).方差分析結(jié)果顯示，Sig.值 < 0.05，表明不同金屬離子對(duì)T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響顯著.

　　圖 6金屬離子對(duì)菌株CB1脫色直接大紅的影響

　　3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化T. versicolor CB1對(duì)直接大紅的脫色

　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取果糖濃度、硝酸銨濃度、CuSO4濃度、CaCl2濃度作為4個(gè)因素進(jìn)行3水平的正交試驗(yàn)(表 1).正交試驗(yàn)脫色7 d后的脫色率及分析結(jié)果見表 2.通過表 2中各因素不同水平均值Ki的比較可得到每個(gè)因素的最大平均值，進(jìn)而得出脫色的最優(yōu)組合為A2B3C2D3，即果糖濃度10 g·L-1、NH4NO32 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl23 mmol·L-1.通過比較各因素不同水平的極差R可知RC>RA>RB>RD，即4個(gè)因素對(duì)染料脫色率的影響大小依次為：CuSO4濃度>果糖濃度>NH4NO3濃度>CaCl2濃度.正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，果糖濃度、硝酸銨濃度、CuSO4濃度、CaCl2濃度對(duì)T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響均顯著，且各因素對(duì)脫色的影響程度排序與極差分析結(jié)果相同.

　　表 2 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株CB1對(duì)直接大紅的脫色　　

　　3.7 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證

　　按正交試驗(yàn)最優(yōu)組合A2B3C2D3，即pH=5、果糖10 g·L-1、硝酸銨2 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl2 3 mmol·L-1，配置染料發(fā)酵液，取此發(fā)酵液40 mL裝于100 mL三角瓶中，接種直徑8 mm菌絲3片，28 ℃下培養(yǎng)7 d的脫色率變化見圖 7.由圖可知，優(yōu)化組合1~7 d的脫色率均高于對(duì)照組脫色率，優(yōu)化組合在第7 d時(shí)的脫色率為78.23%，比對(duì)照組第7 d時(shí)的脫色率(63.07%)提高了24.04%.另外，正交驗(yàn)證第7 d時(shí)的脫色率要高于正交試驗(yàn)中9個(gè)試驗(yàn)組合中的最高脫色率76.08%，表明正交試驗(yàn)得當(dāng)，結(jié)果可靠.

　　圖 7正交試驗(yàn)驗(yàn)證與對(duì)照脫色率

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1) 本研究從野外朽木上分離得到一株可以有效降解直接染料的白腐真菌CB1，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，菌株CB1被鑒定為變色栓菌(Trametes versicolor).

　　2) 為檢測(cè)T. versicolo CB1對(duì)直接染料的脫色能力，進(jìn)行了T. versicolo CB1脫色固體條件下5種直接染料，結(jié)果表明，T. versicolo CB1對(duì)5種直接染料均可脫色，其中對(duì)直接大紅的脫色最為明顯.具體聯(lián)系污水寶或參見http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3) 利用單因素試驗(yàn)對(duì)T. versicolo CB1脫色直接大紅的脫色條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的結(jié)果為：碳源為果糖，氮源為硝酸銨，pH=5，金屬離子為CuSO4和CaCl2.

　　4) 利用正交試驗(yàn)進(jìn)行T. versicolo CB1脫色直接大紅的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為：果糖10 g·L-1、硝酸銨2 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl23 mmol·L-1、pH=5，該條件下第7 d時(shí)的脫色率為78.23%，比優(yōu)化前的脫色率提高了24.04%.