厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)是一種環(huán)境友好的新型生物脫氮工藝，有效解決了傳統(tǒng)生物脫氮工藝碳源需求大和能耗成本高的問(wèn)題，被認(rèn)為是21世紀(jì)最具發(fā)展前景的生物脫氮工藝之一。然而，作為ANAMMOX工藝的關(guān)鍵功能菌，厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)低于其他脫氮細(xì)菌，且對(duì)溫度、pH和DO等外界環(huán)境的要求十分苛刻，使其不得不面臨工藝啟動(dòng)困難，菌種來(lái)源匱乏等問(wèn)題，極大地限制了厭氧氨氧化成為污水處理的主流工藝。ANAMMOX污泥的儲(chǔ)存可有效保留厭氧氨氧化菌(AnAOB)，活化后的ANAMMOX儲(chǔ)存污泥是厭氧氨氧化工藝可靠的菌種來(lái)源之一。因此，在室溫條件下對(duì)厭氧氨氧化污泥進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存，并研究能在短期內(nèi)使其脫氮活性快速恢復(fù)的方法，對(duì)厭氧氨氧化工藝的工程化應(yīng)用具有重要意義。
目前厭氧氨氧化污泥的活性恢復(fù)主要面臨著2個(gè)方面的問(wèn)題：一是儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，污泥的脫氮性能越低，需要的恢復(fù)時(shí)間越長(zhǎng)。黃佳路等研究發(fā)現(xiàn)ANAMMOX污泥的比厭氧氨氧化活性隨儲(chǔ)存時(shí)間呈近乎線性下降(r2為0.978)。二是厭氧氨氧化菌在恢復(fù)過(guò)程中容易被N2氣泡攜帶而從反應(yīng)器中洗脫，導(dǎo)致生物質(zhì)的漂浮。有研究表明，AnAOB分泌的胞外聚合物可以使其緊密附著在生物填料上，從而有效緩解反應(yīng)器內(nèi)部的細(xì)胞沖刷現(xiàn)象，增強(qiáng)系統(tǒng)的生態(tài)穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性。然而，關(guān)于填料對(duì)長(zhǎng)期儲(chǔ)存后的ANAMMOX污泥活性恢復(fù)的影響研究較為稀缺。
本研究將活性良好的厭氧氨氧化污泥置于室溫(15~30℃)條件下進(jìn)行為期9個(gè)月的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，儲(chǔ)存過(guò)程中不提供任何微生物生長(zhǎng)所需的基質(zhì)。通過(guò)比較添加不同填料的厭氧氨氧化反應(yīng)器的污泥顏色變化、脫氮效果和微生物群落特征等情況，探究長(zhǎng)期室溫儲(chǔ)存后的厭氧氨氧化污泥的活性恢復(fù)能力，分析填料在恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮的作用，以期為長(zhǎng)期室溫儲(chǔ)存后的ANAMMOX污泥的活性快速恢復(fù)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。
1、材料與方法
1.1 接種污泥
儲(chǔ)存前的厭氧氨氧化污泥取自某工廠厭氧氨氧化脫氮裝置，污泥濃度2250mg·L-1，呈紅褐色，有良好的沉降性能和厭氧氨氧化活性。將該厭氧氨氧化污泥在室溫條件下避光密封儲(chǔ)存9個(gè)月，期間室內(nèi)環(huán)境最高溫度為30℃，最低溫度為15℃。
污泥活性恢復(fù)前，用氨氮和亞硝態(tài)氮濃度均為10mg·L-1的培養(yǎng)液清洗3遍，接著將污泥粉碎，使其粒徑保持在1mm左右，增大其與培養(yǎng)液的接觸面積，強(qiáng)化污泥恢復(fù)過(guò)程中的生物反應(yīng)。
1.2 實(shí)驗(yàn)用水
本實(shí)驗(yàn)采用人工配水，由(NH4)2SO4和NaNO2提供氮源，通過(guò)0.1mol·L-1 HCl控制pH在7.5~8.0.其他配水組分包括： ρ(NaHCO3)1250mg·L-1， ρ(MgSO4 ·7H2 O)300mg·L-1， ρ(KH2PO4)10mg·L-1， ρ(CaCl2)5.6mg·L-1，微量元素Ⅰ1mL·L-1，微量元素Ⅱ1mL·L-1.微量元素Ⅰ成分： ρ(EDTA)5000mg·L-1， ρ(FeSO4 ·7H2 O)5000mg·L-1;微量元素Ⅱ成分： ρ(EDTA)5000mg·L-1， ρ(MnCl2 ·4H2 O)990mg·L-1， ρ(CuSO4 ·5H2 O)250mg·L-1， ρ(ZnSO4 ·7H2 O)430mg·L-1， ρ(CoCl2 ·6H2 O)240mg·L-1， ρ(Na2MoO4 ·2H2 O)220mg·L-1， ρ(NiCl2 ·6H2 O)190mg·L-1， ρ(H3BO4)14mg·L-1.本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)水中額外投加了ρ(Ca2+)0.03mmol·L-1，以促進(jìn)厭氧氨氧化菌分泌胞外聚合物，幫助受損的厭氧氨氧化菌群附著在填料上并完成再生。考慮到氮?dú)饷撗跣枰渲脺p壓閥、液氮鋼瓶等相對(duì)復(fù)雜的曝氣設(shè)備，每次脫氧需耗時(shí)20min左右，而采用無(wú)水Na2SO3進(jìn)行化學(xué)脫氧只需攪拌15s即可達(dá)到目標(biāo)脫氧效果，且化學(xué)脫氧的成本遠(yuǎn)低于氮?dú)饷撗�，故本研究采用了操作更便捷、成本更低、脫氧更快的無(wú)水亞硫酸鈉還原脫氧法。本實(shí)驗(yàn)投加的無(wú)水Na2SO3濃度約為0.1g·L-1，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，該SO42-濃度對(duì)微生物和基質(zhì)濃度幾乎不產(chǎn)生影響，反應(yīng)式見(jiàn)式(1)。
活性恢復(fù)期間根據(jù)污泥脫氮效果，對(duì)進(jìn)水濃度進(jìn)行了3次提升，詳見(jiàn)表1.
1.3 實(shí)驗(yàn)裝置
本實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示，反應(yīng)器采用有機(jī)玻璃材質(zhì)，有效容積1.0L，其中，每組反應(yīng)器污泥投加量為0.3L，水體體積為0.4L，容積交換率50%，水力停留時(shí)間24h。裝置接口處均采用硅膠密封，以保證反應(yīng)器內(nèi)的厭氧環(huán)境。通過(guò)恒溫水浴振蕩器將裝置溫度控制在(35±1)℃，并以120r·min-1的頻率振蕩，使反應(yīng)器內(nèi)部培養(yǎng)液分布均勻。反應(yīng)器外部用錫紙包裹遮光，防止藻類滋生。
如圖2所示，R2和R3反應(yīng)器內(nèi)分別填充彗星纖維填料(比表面積1100m2 ·m-3)和K3填料(比表面積約500m2 ·m-3)作為生物載體。
1.4 檢測(cè)項(xiàng)目與方法
NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度分別采用納氏試劑分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法測(cè)定，總無(wú)機(jī)氮TIN=[NH4+-N]+[NO2--N]+[NO3--N]。污泥濃度采用重量法測(cè)定，pH采用便攜式pH計(jì)檢測(cè)。
采用16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)研究厭氧氨氧化系統(tǒng)中的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。樣品取自運(yùn)行第35d的3組反應(yīng)器中的ANAMMOX污泥。
2、結(jié)果與討論
2.1 恢復(fù)過(guò)程中污泥的顏色變化
紅色是厭氧氨氧化菌(AnAOB)最顯著的特征，活性恢復(fù)過(guò)程中污泥的顏色變化見(jiàn)圖3.厭氧氨氧化污泥在未補(bǔ)充基質(zhì)的情況下經(jīng)過(guò)9個(gè)月的室溫保存，結(jié)構(gòu)變得細(xì)碎，顏色發(fā)黑，散發(fā)臭味，這是由于在無(wú)基質(zhì)添加的厭氧氨氧化污泥儲(chǔ)存過(guò)程中，AnAOB的胞內(nèi)血紅素不斷衰減，同時(shí)由于菌體死亡水解，黑色硫化物的含量增加，最終逐漸覆蓋住污泥原本的紅色外觀，使污泥呈現(xiàn)黑色。經(jīng)過(guò)42d的運(yùn)行，AnAOB利用包括細(xì)胞色素c在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)，完成菌體的生長(zhǎng)、繁殖和代謝，厭氧氨氧化活性明顯提高。R2和R3反應(yīng)器中可看到明顯的紅色顆粒污泥以及紅色生物膜，而R1反應(yīng)器中的污泥總體顏色較恢復(fù)前雖然發(fā)生了變化，但幾乎看不到紅色顆粒污泥。Kang等的研究發(fā)現(xiàn)色度與比厭氧氨氧化活性顯著相關(guān)(r=0.940)，可以作為一種直觀的厭氧氨氧化活性指標(biāo)。在本研究中，R2和R3反應(yīng)器內(nèi)的厭氧氨氧化活性顯然更高。
2.2 活性恢復(fù)過(guò)程中污泥的脫氮效果
2.2.1 啟動(dòng)階段
本研究采用低氮進(jìn)水和較長(zhǎng)水力停留時(shí)間來(lái)啟動(dòng)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，待污泥脫氮性能逐漸恢復(fù)后，再逐步提高進(jìn)水基質(zhì)濃度，提升系統(tǒng)脫氮負(fù)荷。各階段污泥脫氮效果和化學(xué)計(jì)量比變化見(jiàn)圖4.根據(jù)ANAMMOX反應(yīng)的化學(xué)方程式，本實(shí)驗(yàn)各階段進(jìn)水NH4+-N和NO2--N的化學(xué)計(jì)量比均采用1∶1.32.
第Ⅰ階段(1~10d)，進(jìn)水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別為50mg·L-1和66mg·L-1，水力停留時(shí)間HRT設(shè)定為24h。3組反應(yīng)器經(jīng)過(guò)短暫的適應(yīng)之后脫氮性能均有提升，但處理效果不夠穩(wěn)定，化學(xué)計(jì)量比波動(dòng)較大。由圖4(d)可知，R2和R3反應(yīng)器的氮去除效果明顯優(yōu)于R1反應(yīng)器。Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)填料可以為微生物生長(zhǎng)提供不同的生態(tài)位，實(shí)現(xiàn)氨氧化菌(AOB)和AnAOB等不同菌種的協(xié)同脫氮，故R2和R3反應(yīng)器獲得了更高的氮去除率。在第8d和第10d時(shí)，R2和R3反應(yīng)器內(nèi)的NH4+-N和NO2--N同步去除率均達(dá)到90%以上，系統(tǒng)開(kāi)始出現(xiàn)ANAMMOX反應(yīng)，TIN去除率分別達(dá)82.25%和80.92%，R2反應(yīng)器的脫氮性能略優(yōu)于R3反應(yīng)器。江宇勤等的研究指出生物膜的質(zhì)量會(huì)受到載體的比表面積、生物親和性和表面粗糙度等理化性質(zhì)的影響。相比于K3填料，彗星纖維填料具有更大的比表面積，且表面親和性更強(qiáng)，有利于微生物附著，故R2反應(yīng)器的脫氮性能更佳。
第Ⅱ階段(11~15d)，考慮到恢復(fù)初期反應(yīng)器運(yùn)行效果不穩(wěn)定，易因?yàn)榈?fù)荷的過(guò)大波動(dòng)而造成基質(zhì)濃度抑制現(xiàn)象，第Ⅱ階段對(duì)進(jìn)水基質(zhì)濃度進(jìn)行了小幅提升， ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別提高到80mg·L-1和105.6mg·L-1.圖4(e)顯示，該階段未添加填料的R1反應(yīng)器的化學(xué)計(jì)量比與理論值相差最大，且波動(dòng)最為明顯，原因系R1反應(yīng)器中的AnAOB活性仍較低，尚未占據(jù)主導(dǎo)地位。
2.2.2 負(fù)荷提高和穩(wěn)定運(yùn)行階段
隨著ANAMMOX污泥脫氮性能的逐漸恢復(fù)，第Ⅲ階段(16~25d)，進(jìn)水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別調(diào)整為200mg·L-1和264mg·L-1，水力停留時(shí)間HRT為24h。圖4(a)和圖4(b)顯示，氮負(fù)荷的大幅提高使3組反應(yīng)器的氮去除效果均受到影響而降低，但與R1相比，R2和R3反應(yīng)器受到的波動(dòng)要小得多，添加填料的ANAMMOX反應(yīng)器具有更強(qiáng)的生態(tài)穩(wěn)定性和耐沖擊負(fù)荷能力。
為了進(jìn)一步考察3組ANAMMOX反應(yīng)器的脫氮穩(wěn)定性，第Ⅳ階段(26~42d)，進(jìn)水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)進(jìn)一步提高到300mg·L-1和396mg·L-1。由圖4(d)和圖4(e)可知，與前幾個(gè)階段相比，第Ⅳ階段中3組反應(yīng)器的TIN去除率波動(dòng)幅度明顯減小，化學(xué)計(jì)量比逐漸趨近理論值(NO2--N/NH4+-N等于1.32，NO3--N/NH4+-N等于0.26)，ANAMMOX系統(tǒng)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定運(yùn)行階段。3組反應(yīng)器經(jīng)過(guò)42d的運(yùn)行，脫氮性能均得到有效提升，TIN去除率分別達(dá)78.96%、84.92%和84.66%，NO2--N/NH4+-N分別為1.43、1.35和1.34，略高于理論值1.32，NO3--N/NH4+-N分別為0.21、0.24和0.23，略低于理論值0.26.王賢等的研究指出，不同反應(yīng)裝置的化學(xué)計(jì)量比往往因?yàn)榉磻?yīng)器類型、菌種的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)，所處環(huán)境條件不同而存在差異。一個(gè)良好的ANAMMOX系統(tǒng)往往是多菌種共同協(xié)作的脫氮過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)除了存在氨氧化菌(AOB)將NH4+-N轉(zhuǎn)化成NO2--N外，還存在部分反硝化菌將NO3--N轉(zhuǎn)化為NO2--N，使系統(tǒng)出現(xiàn)NO3--N/NH4+-N略低于理論值，而NO2--N/NH4+-N略高于理論值的現(xiàn)象。結(jié)果顯示，R2和R3反應(yīng)器的TIN去除率顯著優(yōu)于R1反應(yīng)器，在長(zhǎng)期室溫儲(chǔ)存的ANAMMOX污泥的活性恢復(fù)過(guò)程中，填料可以為微生物提供更加穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境，增強(qiáng)ANAMMOX污泥抵抗不利環(huán)境的能力，提高ANAMMOX系統(tǒng)的脫氮穩(wěn)定性。
2.3 微生物群落特征分析
2.3.1 門分類水平上菌群結(jié)構(gòu)分析
圖5所示的是3組反應(yīng)器在門水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)，優(yōu)勢(shì)菌門(相對(duì)豐度>5%)為Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)和Patescibacteria。AnAOB是化能自養(yǎng)型細(xì)菌，目前發(fā)現(xiàn)的AnAOB均屬于浮霉菌門，R1、R2和R3反應(yīng)器中的浮霉菌門占比分別為3.79%、8.71%和8.86%。劉冰等的研究發(fā)現(xiàn)填料的理化特性可顯著影響脫氮功能菌(尤其是AnAOB)的富集效果及活性，添加填料的R2和R3反應(yīng)器獲得了更高的浮霉菌門豐度。
此外，在3組反應(yīng)器中，變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)均占據(jù)了很大的比例(圖6)，這與多數(shù)研究中的厭氧氨氧化系統(tǒng)菌群分布相一致。變形菌門與脫氮過(guò)程密切相關(guān)，在厭氧氨氧化系統(tǒng)中廣泛存在，包括氨氧化細(xì)菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)在內(nèi)的多種微生物都屬于變形菌門，參與脫氮及許多污染物的降解過(guò)程。綠彎菌門常在自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，是起骨架和載體作用的重要伴生功能菌，在ANAMMOX系統(tǒng)中扮演著重要角色。
2.3.2 屬分類水平上菌群結(jié)構(gòu)分析
考察3組反應(yīng)器在屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行分析，不同ANAMMOX反應(yīng)器中的AnAOB豐度及其在浮霉菌門中的占比見(jiàn)表2.熱圖可以通過(guò)可視化的方法直觀地反映微生物的群落組成，污泥樣品中相對(duì)豐度排名前25的屬的分布熱圖見(jiàn)圖7.測(cè)序結(jié)果表明，污泥樣品中典型的ANAMMOX菌屬為CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia，其中， CandidatusJettenia在3組反應(yīng)器中的相對(duì)豐度分別為1.62%、5.74%和5.21%，其在R2反應(yīng)器中的相對(duì)豐度最高，其次是R3反應(yīng)器，添加填料的兩組反應(yīng)器中的CandidatusJettenia的相對(duì)豐度是空白對(duì)照組的3~4倍。 CandidatusBrocadia在3組反應(yīng)器中的相對(duì)豐度均較低，分別為0.57%、1.11%和0.85%。總體來(lái)看，R1、R2和R3反應(yīng)器中的AnAOB在浮霉菌門中的占比分別為57.78%、78.65%和68.40%�？梢园l(fā)現(xiàn)，填料的加入促進(jìn)了AnAOB在浮霉菌門中占據(jù)主導(dǎo)地位，使優(yōu)勢(shì)菌屬更為凸顯。
2.4 厭氧氨氧化生物膜生長(zhǎng)和顆粒污泥形成機(jī)制
一個(gè)良好的ANAMMOX系統(tǒng)中氮的去除往往是以AnAOB為主導(dǎo)功能菌，多種脫氮細(xì)菌綜合作用的結(jié)果，好氧菌和異養(yǎng)菌為AnAOB提供了基質(zhì)和生存環(huán)境。R2和R3反應(yīng)器中的ANAMMOX生物膜如圖8所示。
R2和R3反應(yīng)器中的顆粒污泥主要是通過(guò)生物膜分離形成的，可能的顆�；^(guò)程如圖9所示。生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，包括初始生物量的積累(微生物附著)、發(fā)育(生長(zhǎng))和末端生物量的積累(成熟)。最初，懸浮污泥首先吸附在填料上，逐漸生長(zhǎng)形成生物膜，這時(shí)的生物膜主要由好氧氨氧化菌(AOB)和異養(yǎng)反硝化菌(DEN)組成。待好氧菌把氧氣消耗后，生物膜內(nèi)部出現(xiàn)缺氧區(qū)，為AnAOB的生存提供了有利條件，生物膜上的AnAOB數(shù)量逐漸增多。
胞外聚合物(EPS)是形成生物膜的重要條件，李鴻江等的研究發(fā)現(xiàn)AnAOB分泌的胞外聚合物含量要高于AOB，故其在填料上的掛膜效果顯著優(yōu)于AOB。因此，在良好的生存環(huán)境下，AnAOB利用氮素實(shí)現(xiàn)自身新陳代謝和生長(zhǎng)繁殖，菌體數(shù)量得以增長(zhǎng)，逐漸在填料上形成一層ANAMMOX生物膜并變厚。在機(jī)械振蕩和水力剪切作用下，部分厭氧氨氧化聚集體從過(guò)厚的生物膜外側(cè)分離出來(lái)，逐漸形成顆粒污泥，進(jìn)行菌體的分裂繁殖，實(shí)現(xiàn)CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia數(shù)量的成倍增長(zhǎng)，生物膜上的AnAOB的相對(duì)豐度是空白對(duì)照組的2~4倍。
3、結(jié)論
(1)投加填料構(gòu)建厭氧氨氧化生物膜-顆粒污泥復(fù)合系統(tǒng)，可以有效提高室溫下儲(chǔ)存9個(gè)月的ANAMMOX污泥的活性恢復(fù)速率，投加填料的2組ANAMMOX反應(yīng)器的AnAOB相對(duì)豐度是空白對(duì)照組的2~4倍，填料有效提高了反應(yīng)器中的AnAOB的相對(duì)豐度，且彗星纖維填料的促進(jìn)作用略優(yōu)于K3填料。
(2)在厭氧氨氧化污泥的活性恢復(fù)過(guò)程中，填料可以提高ANAMMOX污泥的耐沖擊負(fù)荷能力，提高系統(tǒng)的生態(tài)穩(wěn)定性和脫氮穩(wěn)定性。（來(lái)源：中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院國(guó)家環(huán)境保護(hù)地下水污染模擬與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）
