厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)工藝具有高效節(jié)能、污泥產(chǎn)量少和無(wú)需外加碳源等顯著優(yōu)勢(shì)，適用于高氨氮廢水處理，如垃圾滲濾液、消化廢水和養(yǎng)殖沼液等。但是ANAMMOX工藝的實(shí)際應(yīng)用受限于ANAMMOX菌難以富集，其倍增時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞產(chǎn)率低。為強(qiáng)化ANAMMOX菌的富集，減少污泥流失，可利用填料的截留作用，構(gòu)建ANAMMOX生物膜系統(tǒng)，有助于工藝啟動(dòng)。

ANAMMOX生物膜反應(yīng)器填料包括：火山巖、沸石、活性炭、聚氨酯海綿、無(wú)紡布和聚乙烯填料等。Wang等的研究運(yùn)行無(wú)紡布固定床反應(yīng)器，經(jīng)39d完成ANAMMOX啟動(dòng)，367d達(dá)到最大氮處理負(fù)荷10.3kg·(m3 ·d)-1，TN去除率90%。王鈞等的研究以聚氨酯海綿作為ANAMMOX生物膜載體，經(jīng)過(guò)73d成功啟動(dòng)反應(yīng)器；穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)，總無(wú)機(jī)氮去除率達(dá)到87.97%。

溫度是影響ANAMMOX生物膜工藝運(yùn)行的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，ANAMMOX菌在10~55℃均有活性，最適溫度30~40℃。曾濤濤的研究考察了火山巖ANAMMOX生物膜反應(yīng)器常溫下的脫氮效果，結(jié)果表明15℃下，進(jìn)水氨氮ρ(NH4+-N)為190mg·L-1，進(jìn)水氮容積負(fù)荷(NLR)為3.4~4.2kg·(m3 ·d)-1，總氮(TN)去除率為42%~55%；當(dāng)溫度升高至20~23℃，進(jìn)水ρ(NH4+-N)為46~78mg·L-1，NLR為2.9~3.2kg·(m3 ·d)-1時(shí)，TN去除率可明顯提高至75%左右。

如何實(shí)現(xiàn)常低溫下ANAMMOX穩(wěn)定脫氮是目前ANAMMOX工藝實(shí)際應(yīng)用面臨的問(wèn)題。本文探討了不同溫度(35~15℃)條件下，無(wú)紡布與改性聚氨酯泡沫塑料填料(改性聚氨酯填料)序批式生物膜反應(yīng)器(sequencebatchbiofilmreactor，SBBR)的脫氮效果和微生物群落變化，以期為ANAMMOX的實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1、材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

SBBR試驗(yàn)裝置如圖1所示。雙層反應(yīng)器內(nèi)層直徑80mm，高240mm，有效容積2L；外層與恒溫水浴鍋相連，控制內(nèi)層反應(yīng)溫度。反應(yīng)器用錫紙包裹以避免光照。

兩組反應(yīng)器分別采用無(wú)紡布填料和改性聚氨酯填料，填充比40%。無(wú)紡布填料材質(zhì)為聚丙烯，購(gòu)自深圳市昌泰無(wú)紡布有限公司。將無(wú)紡布裁剪為約7cm寬的條狀，然后將無(wú)紡布條纏繞在反應(yīng)器中央的填料棒上，細(xì)線(xiàn)扎緊固定。

改性聚氨酯填料為網(wǎng)狀聚氨酯泡沫塑料(購(gòu)自江蘇艾勤環(huán)�？萍加邢薰�司)，將其切割為1.0cm3正方體塊備用；采用低溫等離子體技術(shù)對(duì)填料進(jìn)行表面改性處理。用細(xì)線(xiàn)將填料塊穿起并纏繞固定在反應(yīng)器中央的填料棒上。

1.2 進(jìn)水水質(zhì)

進(jìn)水成分主要包括： ρ236mg·L-1， ρ(NaNO2)296mg·L-1， ρ(MgSO4 ·7H2 O)300mg·L-1， ρ(NaHCO3)為500mg·L-1， ρ(CaCl2 ·2H2 O)為150mg·L-1， ρ(KH2PO4)為30mg·L-1；微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ各1mL·L-1.采用(1+9)HCl調(diào)節(jié)pH為7.5~7.8；為保持厭氧條件，進(jìn)水曝高純N2 15min，使反應(yīng)器內(nèi)DO降至0.3mg·L-1以下。

1.3 SBBR工藝啟動(dòng)與運(yùn)行

1.3.1 接種污泥

無(wú)紡布和改性聚氨酯填料反應(yīng)器均接種ANAMMOX污泥，接種污泥濃度為4000mg·L-1，進(jìn)行掛膜。接種污泥取自1m3的SBR反應(yīng)器，該反應(yīng)器在25~30℃條件下運(yùn)行，水力停留時(shí)間16h，進(jìn)水ρ(TN)為500~800mg·L-1，出水ρ(TN)低于50mg·L-1，TN去除率在90%以上。

1.3.2 SBBR工藝啟動(dòng)

啟動(dòng)期，控制恒溫35℃，啟動(dòng)ANAMMOX生物膜反應(yīng)器。兩反應(yīng)器的進(jìn)水NLR為110mg·(L·d)-1，其中ρ(NH4+-N)為50mg·L-1， ρ(NO2--N)為60mg·L-1.試驗(yàn)運(yùn)行周期為24h：進(jìn)水15min，反應(yīng)時(shí)間23h，靜沉30min，排水15min；排水比90%。穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)，無(wú)紡布填料反應(yīng)器的TN去除率長(zhǎng)期處于60%~85%；改性聚氨酯填料反應(yīng)器的TN去除率基本保持在80%以上。

1.3.3 運(yùn)行

對(duì)已經(jīng)成功啟動(dòng)并穩(wěn)定運(yùn)行一個(gè)月的無(wú)紡布填料和改性聚氨酯填料反應(yīng)器進(jìn)行降溫試驗(yàn)，共5個(gè)階段，溫度梯度設(shè)置為35、30、25、20和15℃，每個(gè)溫度條件下運(yùn)行20~25d。溫度變化時(shí)，分兩次降溫：第一次降溫3℃，穩(wěn)定3d后，再降溫2℃至所需溫度。

1.4 分析項(xiàng)目與檢測(cè)方法

1.4.1 常規(guī)氮指標(biāo)檢測(cè)

每個(gè)試驗(yàn)運(yùn)行周期結(jié)束時(shí)，取水樣測(cè)定氮指標(biāo)。NH4+-N、NO2--N和NO3--N均采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)，TN為NH4+-N、NO2--N和NO3--N三者之和；pH和DO分別采用便攜式pH計(jì)(Jenco，6010M，USA)和便攜式溶解氧儀(Hach，HQ30d，USA)測(cè)定。

1.4.2 微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析方法

(1)DNA的提取在35、25和15℃穩(wěn)定運(yùn)行期間，剪取適量改性聚氨酯生物膜填料，與反應(yīng)器出水一同置于50mL離心管中，保證填料被浸沒(méi)。用多管振蕩儀振蕩10min至生物膜充分脫落。將泥水混合物在轉(zhuǎn)速3000r·min-1下離心3min，棄去上清液，保留泥樣提取DNA。采用土壤DNA提取試劑盒(OmegaBio-Tek，Inc。，Norcross，GA，USA)提取微生物基因組DNA。

(2)高通量測(cè)序?qū)μ崛〕龅?/span>DNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)。對(duì)所擴(kuò)增的16SrRNA中的V3-V4區(qū)域，進(jìn)行小片段基因文庫(kù)的構(gòu)建，并基于IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。經(jīng)過(guò)Reads拼接過(guò)濾，對(duì)所有樣本的有效數(shù)據(jù)(effectivetags)，以97%的一致性(identity)進(jìn)行OTUs(operationaltaxonomicunits)聚類(lèi)，然后對(duì)OTUs的序列進(jìn)行物種注釋豐度分析，揭示樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)的差異。

2、結(jié)果與討論

2.1 不同溫度下ANAMMOX生物膜工藝的脫氮效果

不同溫度條件下，無(wú)紡布和改性聚氨酯泡沫塑料填料反應(yīng)器進(jìn)出水ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)和TN去除率見(jiàn)圖2，化學(xué)計(jì)量系數(shù)變化如圖3所示。

進(jìn)水ρ(TN)為110mg·L-1時(shí)，在35、30、25、20和15℃運(yùn)行期間，無(wú)紡布填料反應(yīng)器TN平均去除率分別為71.16%、76.19%、75.15%、72.68%和61.11%，而改性聚氨酯填料反應(yīng)器TN平均去除率分別為78.71%、80.16%、79.78%、81.75%和75.68%。

在降溫過(guò)程中，無(wú)紡布填料反應(yīng)器TN去除率在30℃時(shí)達(dá)到最大值76.19%，在35~20℃條件下均保持70%以上的TN去除率，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N在1.34~1.45之間，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N在0.42~0.51之間；降溫至15℃時(shí)，TN去除率降低至61.11%，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N降至1.09，低于ANAMMOX反應(yīng)理論值1.32，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N降至0.41，但仍高于ANAMMOX反應(yīng)理論值0.26.化學(xué)計(jì)量系數(shù)與ANAMMOX反應(yīng)理論值的偏差說(shuō)明反應(yīng)器中還存在其他氮轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。ΔNO2--N∶ΔNH4+-N偏高說(shuō)明系統(tǒng)中存在反硝化反應(yīng)，偏低可能是由于硝化過(guò)程中的氨氧化或短程反硝化反應(yīng)；ΔNO3--N∶ΔNH4+-N偏高說(shuō)明有硝化反應(yīng)中的亞硝酸鹽氧化過(guò)程發(fā)生，偏低說(shuō)明有全程或短程反硝化反應(yīng)�？梢钥闯�，隨著溫度降低，無(wú)紡布填料反應(yīng)器中的硝化反應(yīng)增強(qiáng)，反硝化反應(yīng)減弱。改性聚氨酯填料反應(yīng)器在35~20℃條件下，TN去除率均保持80%左右；降溫至15℃時(shí)，TN去除率降至75.68%，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N從1.23~1.41降至1.16，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N從0.28~0.33降至0.24；降溫過(guò)程中，氨氧化和反硝化反應(yīng)增強(qiáng)，亞硝酸鹽氧化減弱。

這一現(xiàn)象與李祥等的研究結(jié)果相似：溫度在26~37℃時(shí)，ANAMMOX生物膜反應(yīng)器氮去除速率在1.51~1.84kg·(m3 ·d)-1之間，變化幅度4.35%，當(dāng)溫度低于20℃時(shí)，去除速率快速下降，尤其當(dāng)溫度低于15℃時(shí)，氮去除速率下降至0.55kg·(m3 ·d)-1，同時(shí)出現(xiàn)大量NO2--N積累。宋成康等實(shí)驗(yàn)運(yùn)行SBR反應(yīng)器，在20~33℃可穩(wěn)定ANAMMOX脫氮，其中TN去除負(fù)荷穩(wěn)定在0.4g·(L·d)-1左右；但當(dāng)溫度為15℃時(shí)，出現(xiàn)NO2--N積累。溫度降低導(dǎo)致厭氧氨氧化活性下降和活化能提高，使ANAMMOX脫氮效率下降。

在相同溫度條件下，與無(wú)紡布填料反應(yīng)器相比，改性聚氨酯填料反應(yīng)器TN去除率更高，化學(xué)計(jì)量系數(shù)更接近ANAMMOX理論值；在降溫過(guò)程中，改性聚氨酯填料反應(yīng)器TN去除率的下降幅度更小�？梢钥闯�，改性聚氨酯填料相對(duì)于無(wú)紡布填料能夠達(dá)到更好的脫氮效果，同時(shí)對(duì)低溫適應(yīng)能力更強(qiáng)。這可能是因?yàn)楦男跃郯滨ヌ盍系亩嗫捉Y(jié)構(gòu)更易形成并維持厭氧環(huán)境，從而更有利于ANAMMOX反應(yīng)。因此，改性聚氨酯填料可以作為ANAMMOX生物膜工藝的優(yōu)選填料；同時(shí)改性聚氨酯填料反應(yīng)器75%以上的TN去除率也說(shuō)明ANAMMOX生物膜工藝具有常低溫下處理廢水的潛力。

2.2 35、25和15℃條件下改性聚氨酯填料生物膜菌群分析

選取脫氮效果較好的改性聚氨酯填料反應(yīng)器，分別在35、25和15℃穩(wěn)定運(yùn)行期間取3個(gè)平行泥樣，檢測(cè)其微生物群落的變化。

2.2.1 基于門(mén)水平的微生物群落分布

采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析微生物的特異性DNA片段，根據(jù)OTUs序列的物種注釋結(jié)果對(duì)菌群進(jìn)行結(jié)構(gòu)組成分析，得到不同溫度條件下改性聚氨酯填料生物膜在門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度如圖4(a)所示。

結(jié)果表明，改性聚氨酯填料反應(yīng)器中的主要微生物菌群包括浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)等。ANAMMOX菌所屬的浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)，在35、25和15℃的污泥樣品中分別占33%、26%和41%，相對(duì)豐度最高。除此之外，變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)在3個(gè)溫度條件下的相對(duì)豐度也較高，分別占30%、19%和8%(35℃)，28%、22%和13%(25℃)，26%、10%和6%(15℃)。這幾類(lèi)相對(duì)豐度較高的細(xì)菌與ANAMMOX菌之間存在協(xié)同和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，同時(shí)得到富集，成為系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)微生物。

2.2.2 基于屬水平的微生物群落分布

由圖4(b)可知，35℃和25℃下ANAMMOX菌屬CandidatusKuenenia的相對(duì)豐度分別為8%和5%，而15℃條件下， CandidatusKuenenia的相對(duì)豐度達(dá)到16%，說(shuō)明溫度降低沒(méi)有對(duì)功能菌的富集產(chǎn)生影響。從35℃到25℃功能菌相對(duì)豐度下降可能是因?yàn)槎唐趦?nèi)溫度的下降對(duì)ANAMMOX菌活性產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致增殖速度減緩，但由于CandidatusKuenenia對(duì)20℃以下環(huán)境溫度的良好適應(yīng)性，很快恢復(fù)了活性，實(shí)現(xiàn)了增殖，在15℃達(dá)到相對(duì)豐度最大值16%。降溫過(guò)程對(duì)ANAMMOX菌利用基質(zhì)的影響大于對(duì)增殖的影響，因此，15℃條件下雖然功能菌的豐度達(dá)到最大，但是脫氮能力弱于25℃和35℃條件下的脫氮能力。

Pseudomonas、Denitratisoma和Thauera等多個(gè)具有反硝化作用的屬也在反應(yīng)器中共存。其中Pseudomonas和Denitratisoma的相對(duì)豐度較高，在不同溫度條件下的相對(duì)豐度分別為7.4%和1.9%(35℃)、3.4%和5.4%(25℃)、5.6%和7.4%(15℃)。與CandidatusKuenenia類(lèi)似，反硝化菌屬Pseudomonas在降溫過(guò)程中出現(xiàn)了先適應(yīng)，后恢復(fù)并增殖的現(xiàn)象。 Denitratisoma則比較適應(yīng)低溫的環(huán)境，隨著溫度的降低，相對(duì)豐度逐漸升高。系統(tǒng)中還存在硝化細(xì)菌，包括AOB屬Nitrosomonas和NOB屬unidentified_Nitrospiraceae。在溫度從35℃降至25℃再到15℃的過(guò)程中， Nitrosomonas相對(duì)豐度從0.6%上升到1.2%，又降至1.0%； unidentified_Nitrospiraceae 相對(duì)豐度則持續(xù)下降，從0.61%到0.37%再到0.07%。

降溫過(guò)程對(duì)不同脫氮細(xì)菌的活性影響不同。35、25和15℃條件下，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N和ΔNO3--N∶ΔNH4+-N分別為1.35和0.33、1.41和0.32、1.16和0.24.降溫至25℃時(shí)，ΔNO2--N∶ΔNH4+-N有明顯升高，但是ΔNO3--N∶ΔNH4+-N基本不變，兩個(gè)化學(xué)計(jì)量系數(shù)又都高于ANAMMOX理論值，說(shuō)明此時(shí)除ANAMMOX之外還發(fā)生亞硝酸鹽氧化和反硝化反應(yīng)，NOB和反硝化菌(denitrifyingbacteria，DNB)占據(jù)較大優(yōu)勢(shì)。繼續(xù)降溫至15℃時(shí)，ΔNO2--N∶ΔNH4+-N和ΔNO3--N∶ΔNH4+-N均降低且低于ANAMMOX理論值，說(shuō)明此時(shí)發(fā)生的脫氮副反應(yīng)主要為氨氧化和反硝化，AOB和DNB的優(yōu)勢(shì)大于NOB�；瘜W(xué)計(jì)量系數(shù)和物種豐度變化都表明，降溫過(guò)程對(duì)不同脫氮細(xì)菌的代謝和增殖產(chǎn)生了不同影響。

2.2.3微生物群落差異分析

為了比較不同溫度下的微生物群落構(gòu)成，將所有樣本的物種注釋結(jié)果和OTUs的豐度信息合并處理后，進(jìn)行降維分析，從中發(fā)現(xiàn)不同樣本間的差異。

對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)如圖5(a)所示。從中可知，15、25和35℃條件下的生物膜群落構(gòu)成有顯著差異，且從各組之間的距離可以看出，各組間的差異程度相近。無(wú)度量多維標(biāo)定法(non-metricmulti-dimensionalscaling，NMDS)分析能夠克服PCA線(xiàn)性模型的缺點(diǎn)，更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線(xiàn)性結(jié)構(gòu)。NMDS分析的結(jié)果見(jiàn)圖5(b)，35℃條件下的生物膜菌群組成與其它兩組差異較大，說(shuō)明溫度顯著影響了生物膜群落結(jié)構(gòu)。

3、結(jié)論

(1)在NLR為110mg·(L·d)-1，溫度由35℃逐步降至15℃的過(guò)程中，無(wú)紡布填料反應(yīng)器的平均TN去除率先由71.16%(35℃)提升至76.19%(30℃)后又降低至61.11%(15℃)，而改性聚氨酯泡沫塑料填料的平均TN去除率先由78.71%(35℃)提升至81.75%(20℃)后又降低至75.68%(15℃)。

(2)與無(wú)紡布填料反應(yīng)器相比，在相同條件下，改性聚氨酯填料反應(yīng)器的脫氮效果好于無(wú)紡布填料反應(yīng)器，這說(shuō)明改性聚氨酯填料反應(yīng)器系統(tǒng)對(duì)溫度波動(dòng)的適應(yīng)能力更強(qiáng)，更易在常低溫環(huán)境下實(shí)現(xiàn)較好的脫氮效果。

(3)高通量測(cè)序結(jié)果表明，改性聚氨酯填料生物膜主要ANAMMOX菌屬為CandidatusKuenenia，相對(duì)豐度分別為8%(35℃)、5%(25℃)和16%(15℃)，說(shuō)明低溫條件下， CandidatusKuenenia仍會(huì)增殖富集。溫度顯著影響了生物膜群落結(jié)構(gòu)。（來(lái)源：天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南城建集團(tuán)有限公司）