污泥作為污水處理的末端產(chǎn)物，其總量不斷增加，如果隨意排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，因此，采用合理的方法解決污泥問(wèn)題成為當(dāng)下研究的重點(diǎn)。衛(wèi)生填埋法和焚燒法均對(duì)環(huán)境有一定的危害，而厭氧消化作為一種環(huán)境友好型污泥處理手段，其中間產(chǎn)物揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）是一種高附加值的小分子有機(jī)碳物質(zhì)，不僅可以用于污水脫氮除磷，解決污水處理廠碳源不足的問(wèn)題，還可作為合成生物可降解塑料（PHAs）的原材料，對(duì)環(huán)境污染小且應(yīng)用價(jià)值高。因此，污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)VFAs在污泥資源化處理中應(yīng)用更為廣泛。

水解過(guò)程是污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的限速步驟，生物酶法和超聲處理均可以加快污泥水解進(jìn)程，且整個(gè)過(guò)程綠色環(huán)保，無(wú)二次污染。超聲產(chǎn)生的羥基自由基（·OH）和瞬時(shí)高溫高壓，可以有效分解污泥中微生物的胞外聚合物（EPS）和細(xì)胞壁，已有報(bào)道表明超聲在污泥減量中實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化應(yīng)用，然而高能耗是限制該技術(shù)發(fā)展的重要因素。生物酶對(duì)微生物降解具有高效催化性，Luo等利用淀粉酶和蛋白酶強(qiáng)化剩余污泥的溶胞水解及污泥減量，最佳酶投加量為60mg/gTS，VSS去除率高達(dá)39.70%，且復(fù)合酶（蛋白酶∶淀粉酶=3∶1）效果優(yōu)于單一酶，VFAs產(chǎn)量為空白對(duì)照組的2.04倍。

生物酶和超聲對(duì)污泥處理均有一定優(yōu)勢(shì)，然而關(guān)于兩種技術(shù)聯(lián)用的報(bào)道較少。超聲可以實(shí)現(xiàn)污泥絮體和微生物的初步解體，然后通過(guò)生物酶強(qiáng)化污泥厭氧水解產(chǎn)酸過(guò)程，兩種技術(shù)聯(lián)用在發(fā)揮各自?xún)?yōu)勢(shì)的同時(shí)能夠降低系統(tǒng)能耗。筆者采用超聲聯(lián)合生物酶技術(shù)強(qiáng)化剩余污泥有機(jī)質(zhì)水解和產(chǎn)VFAs，并通過(guò)高通量測(cè)序?qū)�厭氧發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，從生物學(xué)角度揭示超聲和生物酶聯(lián)用技術(shù)強(qiáng)化污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸機(jī)理。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用剩余污泥取自天津市某污水處理廠二沉池，該污水廠采用的是活性污泥法。剩余污泥靜置24h后，棄去表層上清液，于4℃冰箱中保存。污泥性質(zhì)如下：pH=7.32，TSS=7332mg/L，VSS=4671mg/L，TCOD=6232mg/L，SCOD=89mg/L，TN=12mg/L，TP=0.8mg/L。所用生物酶為纖維素酶、α淀粉酶、溶菌酶和復(fù)合酶（纖維素酶∶α-淀粉酶∶溶菌酶=1∶1∶3）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)控制參數(shù)參考文獻(xiàn)，將1800mL剩余污泥投入2000mL燒杯，置于超聲破碎儀處理5min，其中超聲振幅為80％，頻率為20kHz。將處理后的污泥投入?yún)捬醢l(fā)酵反應(yīng)器中，生物酶投加量為污泥干質(zhì)量的2.5％，充入氮?dú)�，機(jī)械攪拌速度維持為（90±10）r/min。厭氧發(fā)酵反應(yīng)器置于恒溫水浴鍋中，溫度維持在35℃左右，設(shè)置發(fā)酵時(shí)間為14d，每48h取樣一次，經(jīng)0.45μm濾膜后測(cè)定VFAs，每次實(shí)驗(yàn)做3組平行。發(fā)酵結(jié)束后，取產(chǎn)酸量最佳的樣品和對(duì)照組污泥置于-25℃冰箱中儲(chǔ)存，后續(xù)進(jìn)行微生物群落分析。

1.3 檢測(cè)方法

TSS和VSS根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，SCOD、TN和TP等采用哈希試劑法測(cè)定，pH采用pH計(jì)測(cè)定，污泥粒徑采用激光粒度分析儀檢測(cè)。

VFAs采用氣相色譜法測(cè)定，取樣后經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，酸化至pH<4，最后進(jìn)樣測(cè)量，采用氫火焰離子化檢測(cè)器和Agilent19091J-413色譜柱（30m×320μm×0.25μm）。色譜條件如下：設(shè)置進(jìn)樣口溫度為260℃，初始柱溫為80℃，進(jìn)樣體積為0.2μL；檢測(cè)器溫度為280℃，分流比為30∶1。最后按照乙酸為1.07、丙酸為1.51、正丁酸和異丁酸為1.82、正戊酸和異戊酸為2.04的換算系數(shù)，將溶解性脂肪酸（SCFAs）濃度轉(zhuǎn)化為COD濃度。

微生物多樣性分析采用Illumina公司的MiSeqPE300/NovaSeqPE250進(jìn)行測(cè)序，使用快速DNASPIN試劑盒提取污泥DNA，采用真/古細(xì)菌兼容通用前端引物341F（5'-CCTACGGGRBGCAGCAG-3'）和后端引物806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTA-3'）對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2、結(jié)果與討論

2.1 超聲對(duì)污泥性能的影響

超聲處理前污泥上清液中SCOD、TN和TP濃度分別為89、12和0.8mg/L，處理后分別為338、104和4.3mg/L，相較于處理前分別增加了279.8％、766.7％和437.5％。原因在于低頻超聲的機(jī)械剪切力和空化效應(yīng)可以充分破壞污泥絮體和微生物細(xì)胞，在較短的處理時(shí)間內(nèi)（5min）污泥溶出有機(jī)質(zhì)濃度明顯上升。

處理前污泥的比表面積為0.279m2/g，處理后為0.413m2/g，表明超聲可以有效解體污泥的絮體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致單位質(zhì)量污泥的表面積增大。超聲處理后污泥的D90（90%顆粒粒徑）由低于470.86μm降至258.90μm以下，同時(shí)污泥的D50（平均粒徑）由80.908μm下降至43.362μm，推測(cè)超聲破壞了污泥菌膠團(tuán)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致絲狀菌破裂，由絲狀菌連接的微生物細(xì)胞和EPS被分散。因此，超聲預(yù)處理可以有效破壞污泥的表觀結(jié)構(gòu)，增大污泥比表面積，降低污泥粒徑，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)溶有機(jī)質(zhì)釋放，為生物酶強(qiáng)化污泥發(fā)酵產(chǎn)酸降低傳質(zhì)阻力。

2.2 生物酶對(duì)剩余污泥VSS去除率的影響

VSS去除率可表示顆粒有機(jī)物的水解效果，剩余污泥VSS去除率隨發(fā)酵時(shí)間的變化見(jiàn)圖1。

由圖1可知，與空白對(duì)照相比，超聲聯(lián)合生物酶對(duì)污泥水解有顯著促進(jìn)作用，其效果排序?yàn)椋簭?fù)合酶>溶菌酶>α-淀粉酶>纖維素酶>空白對(duì)照，其中復(fù)合酶作用下的污泥VSS去除率最高達(dá)到44.2％。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，VSS去除率在0~2d明顯提高，其中復(fù)合酶作用下的VSS去除率增加幅度最大即37％，空白對(duì)照增加幅度最小即5.3％。原因是復(fù)合酶可以從多個(gè)活性點(diǎn)位水解污泥，破壞污泥絮體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)污泥中微生物細(xì)胞和EPS降解，有效實(shí)現(xiàn)污泥減量。這與Yang等研究結(jié)果相似，Yang等發(fā)現(xiàn)相較于單一酶，混合酶（蛋白酶∶淀粉酶=1∶3）對(duì)污泥的溶解效果更好，在溫度為50℃時(shí)，污泥水解效率由10％（對(duì)照實(shí)驗(yàn)）提高到68.43％。

2.3 生物酶對(duì)剩余污泥VFAs的影響

VFAs由乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸和正戊酸組成，圖2為不同生物酶處理下剩余污泥VFAs隨發(fā)酵時(shí)間的變化。

由圖2可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，VFAs濃度先升高后降低，除對(duì)照組外，均在第4天達(dá)到峰值，VFAs濃度排序?yàn)椋簭?fù)合酶>溶菌酶>纖維素酶>α-淀粉酶>空白對(duì)照，分別為1209.2、929.4、724.3、641.9和192.6mg/L。其原因在于經(jīng)超聲聯(lián)合生物酶處理后的污泥發(fā)酵系統(tǒng)中，污泥絮體破碎，有機(jī)質(zhì)大量溶出，同時(shí)產(chǎn)酸菌群在生物酶的催化作用下高效地將有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為VFAs。在第4天后，VFAs濃度顯著降低，這主要是由于隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)甲烷菌將VFAs轉(zhuǎn)化為CO2、甲烷等氣體。

2.4 VFAs組成分析

生物酶污泥處理系統(tǒng)產(chǎn)酸累積量的最大值出現(xiàn)在第4天，因此有必要對(duì)第4天VFAs的組成進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在復(fù)合酶污泥系統(tǒng)中，乙酸濃度最大即736.3mg/L，遠(yuǎn)高于其他酸的濃度，且在所有發(fā)酵系統(tǒng)中，復(fù)合酶系統(tǒng)所產(chǎn)生的乙酸量最高，說(shuō)明超聲聯(lián)合復(fù)合酶處理加快了污泥水解進(jìn)程，增大了剩余污泥中有機(jī)物濃度，促進(jìn)了丙酸、丁酸和戊酸等向小分子乙酸轉(zhuǎn)化，使污泥水解更為徹底。乙酸作為污泥發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的優(yōu)質(zhì)有機(jī)碳，可以在發(fā)酵液的后續(xù)利用中直接用于補(bǔ)充污水處理系統(tǒng)的碳源。

2.5 微生物群落分析

2.5.1 Alpha多樣性指數(shù)分析

第4天微生物群落的Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，第4天空白對(duì)照組、溶菌酶系統(tǒng)和復(fù)合酶系統(tǒng)的序列數(shù)均大于20000；Coverage是反映測(cè)序深度的指數(shù)，其值均大于0.99，兩者說(shuō)明所收集的基因序列可以很好地代表污泥中的微生物群落，足以反映樣品的大部分信息�？瞻讓�(duì)照組的Chao指數(shù)高于溶菌酶和復(fù)合酶系統(tǒng)，說(shuō)明空白對(duì)照組污泥的微生物豐度更高。Simpson和Shannon指數(shù)反映了樣品中微生物的多樣性，溶菌酶和復(fù)合酶系統(tǒng)污泥的兩個(gè)指數(shù)均低于空白對(duì)照組，可能是因?yàn)槌�聲�?lián)合生物酶處理過(guò)程強(qiáng)化了與水解酸化相關(guān)的功能微生物，而關(guān)聯(lián)度較小的微生物被淘汰，使得生物酶系統(tǒng)表現(xiàn)出相對(duì)較低的物種豐度。

2.5.2 操作分類(lèi)單元（OTUs）韋恩圖分析

微生物群落的OTUs韋恩圖見(jiàn)圖4，其中A1、B1、C1分別代表空白對(duì)照組、溶菌酶系統(tǒng)、復(fù)合酶系統(tǒng)。

由圖4可知，相較于溶菌酶和復(fù)合酶系統(tǒng)，空白對(duì)照組的OTUs數(shù)分別增加了1047和1042，說(shuō)明生物酶系統(tǒng)中污泥的微生物豐度較低�？瞻讓�(duì)照組和復(fù)合酶系統(tǒng)的OTUs共享數(shù)在空白對(duì)照組總數(shù)中占比較小，表明污泥中微生物群落隨超聲和生物酶的作用而發(fā)生改變，表現(xiàn)出較大差異。復(fù)合酶和溶菌酶系統(tǒng)單獨(dú)所有的OTUs數(shù)分別占總數(shù)的27.24％和27.17％，表明超聲聯(lián)合復(fù)合酶與溶菌酶對(duì)污泥的作用效果存在一定差別，不同生物酶使得污泥中微生物的種類(lèi)和數(shù)量發(fā)生改變。

2.5.3 門(mén)水平物種組成

為進(jìn)一步闡明聯(lián)合處理后污泥的厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸機(jī)理，就復(fù)合酶系統(tǒng)（C1）、溶菌酶系統(tǒng)（B1）和空白對(duì)照組（A1）進(jìn)行了門(mén)水平上的微生物群落分析，其物種組成見(jiàn)圖5。

由圖5可以看出，在復(fù)合酶系統(tǒng)中，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）占主導(dǎo)地位，為總序列的93.2％；在溶菌酶系統(tǒng)中，Firmicutes和Proteobacteria占主導(dǎo)地位，為總序列的87.9％；而空白對(duì)照組物種分布較為均勻，Proteobacteria占比最高為40.3％，Firmicutes和Bacteroidetes僅占1.5％和4.8％。由此可見(jiàn)，超聲聯(lián)合生物酶的作用改變了微生物豐度，提高了Firmicutes和Bacteroidetes的占比。Firmicutes中大部分微生物與碳水化合物的水解和產(chǎn)酸活性相關(guān)，能夠?qū)⒗w維素等復(fù)雜碳水化合物降解為乙酸和丁酸等小分子有機(jī)物。Bacteroidetes能夠產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶等水解酶，將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為CO2、葡萄糖和乙酸，此為本研究中復(fù)合酶系統(tǒng)污泥產(chǎn)VFAs和乙酸量大的主要原因。相比之下，溶菌酶系統(tǒng)中Firmicutes豐度最高，Bacteroidetes豐度較低。相較于空白對(duì)照，聯(lián)合處理后污泥中Proteobacteria的占比降低，Proteobacteria在厭氧消化過(guò)程中會(huì)消耗生成的短鏈脂肪酸，其豐度的降低有利于VFAs的累積。

2.5.4 屬水平物種組成

圖6為屬水平物種組成熱圖。相比空白對(duì)照，經(jīng)超聲聯(lián)合生物酶處理后的污泥微生物種類(lèi)和豐度發(fā)生了明顯變化，在復(fù)合酶系統(tǒng)中，梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium_sensu_stricto_11）、普氏菌屬（Prevotella_7）、丙酸螺菌屬（Propionispira）、小桿菌屬（Dialister）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）等水解產(chǎn)酸菌屬豐度顯著提高。其中部分Clostridium_sensu_stricto_11（如丁酸梭菌）可分解碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸，如乙酸、丙酸和丁酸等。Prevotella_7可以淀粉為生長(zhǎng)底物，同時(shí)也能加速蛋白質(zhì)的代謝。Dialister可以促進(jìn)污泥產(chǎn)酸產(chǎn)氣，Propionispira和Acetobacter均可以利用糖類(lèi)，并將其轉(zhuǎn)化為乙酸。由此可知，在超聲聯(lián)合復(fù)合酶的作用下，污泥中產(chǎn)乙酸菌屬占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，VFAs和乙酸累積量明顯增加。

相比之下，在溶菌酶系統(tǒng)中，屠場(chǎng)桿狀菌屬（Macellibacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）和嚴(yán)格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）等豐度顯著提高。Macellibacteroides作為擬桿菌屬的一種，可以利用葡萄糖和其他碳水化合物產(chǎn)生乙酸、正丁酸和異丁酸等。Lactobacillus、Romboutsia和Clostridium_sensu_stricto_1均具有較強(qiáng)的代謝碳水化合物和蛋白質(zhì)的能力，可以促進(jìn)VFAs的生成。

3、結(jié)論

①超聲對(duì)污泥性質(zhì)影響顯著，經(jīng)超聲處理后，污泥上清液溶出SCOD、TN和TP濃度明顯提高，污泥粒徑減小，比表面積增大，有利于污泥的厭氧發(fā)酵水解和產(chǎn)酸過(guò)程。

②超聲聯(lián)合生物酶促進(jìn)污泥水解和產(chǎn)酸，其中復(fù)合酶的效果最佳，污泥VSS去除率最高可達(dá)44.2％，VFAs最大產(chǎn)量為1209.2mg/L，其中乙酸量為736.3mg/L。

③微生物測(cè)序結(jié)果表明，經(jīng)超聲聯(lián)合復(fù)合酶和溶菌酶處理后的污泥微生物豐度和多樣性與空白對(duì)照呈現(xiàn)明顯差異。從門(mén)水平來(lái)看，Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes等水解產(chǎn)酸菌門(mén)在復(fù)合酶系統(tǒng)污泥中占主導(dǎo)地位；從屬水平上來(lái)看，Clostridium_sensu_stricto_11、Propionispira和Acetobacter等水解產(chǎn)酸菌屬豐度相較于空白對(duì)照均明顯增加。（來(lái)源：中海油天津化工研究設(shè)計(jì)院有限公司，河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院）