1 引言

　　石油工業(yè)的發(fā)展使得石油污染土壤呈日益擴(kuò)大化趨勢(shì).石油中的烷烴類、芳香烴類及苯類物質(zhì)毒性大且具有致癌作用，進(jìn)入土壤后難以去除，并會(huì)引起土壤理化性質(zhì)變化和地下水污染等一系列重大生態(tài)問(wèn)題，因此，如何修復(fù)石油污染土壤已成為世界性的環(huán)境問(wèn)題.石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)因具有投入成本低、對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境破壞作用小、無(wú)二次污染和可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，正逐步成為石油污染土壤治理領(lǐng)域的一個(gè)具有廣闊應(yīng)用前景的研究方向.然而，石油污染土壤生物修復(fù)的成功運(yùn)作并非易事.理論與實(shí)踐證明，恢復(fù)污染土壤至其原有的生態(tài)功能是一個(gè)長(zhǎng)期而復(fù)雜的系統(tǒng)生態(tài)過(guò)程.在生物修復(fù)過(guò)程中，污染土壤逐漸向健康狀態(tài)恢復(fù)，并伴隨著一系列生化指標(biāo)的變化.因此，有必要對(duì)土壤的生物修復(fù)過(guò)程及此過(guò)程中土壤的健康狀況進(jìn)行指示、監(jiān)測(cè)及生態(tài)毒理學(xué)研究.

　　研究表明，土壤生態(tài)系統(tǒng)中的敏感指示物或指示指標(biāo)能較全面地反映土壤生態(tài)毒性.將土壤生態(tài)毒性指示與化學(xué)診斷方法有效結(jié)合起來(lái)，能夠更為全面、有效地表征土壤的整體健康狀況.針對(duì)石油污染土壤生態(tài)毒性指示和評(píng)價(jià)系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了包括土壤酶活性試驗(yàn)、高等植物毒性試驗(yàn)、蚯蚓毒性試驗(yàn)和發(fā)光菌毒性試驗(yàn)在內(nèi)的多種生態(tài)毒性試驗(yàn)方法.有學(xué)者考察了柴油污染土壤生物修復(fù)過(guò)程中土壤酶活性的變化情況，結(jié)果表明，β葡萄糖苷活性與土壤中石油烴殘留量呈顯著正相關(guān)，而土壤脫氫酶和脂肪酶與石油烴殘留量顯顯著負(fù)相關(guān).Banks等采用萵苣、粟、蘿卜、紅三葉草和小麥作為供試對(duì)象，以它們的種子發(fā)芽率為依據(jù)，考察了它們的適用性，結(jié)果表明，只有萵苣種子能較好地表征石油污染土壤和未受石油污染土壤的生態(tài)毒性差異.Wang等采用蚯蚓(Esisenia foelide)來(lái)評(píng)價(jià)中國(guó)勝利油田污泥的生態(tài)毒性，結(jié)果表明，去繁殖率、卵繭量和回避行為等指標(biāo)能很好地指示該污泥的生態(tài)毒性.Chaineau等采用發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)480 d生物堆肥后的石油污染土壤的生態(tài)毒性，得出在最初土壤毒性最大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤毒性逐漸減弱，但仍存在較高的毒性.同時(shí)，通過(guò)發(fā)光細(xì)菌生態(tài)毒性試驗(yàn)研究了兩種不同堆肥條件下的石油污染土壤，發(fā)現(xiàn)自然條件下堆肥處理(8個(gè)月)的毒性是人工強(qiáng)化堆肥的2~4倍.

　　在這些生態(tài)毒性指示方法中，高等植物毒性試驗(yàn)以其相關(guān)性好、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)而被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛用于石油污染土壤修復(fù)過(guò)程中土壤生態(tài)毒性的檢測(cè)與評(píng)價(jià).另外，高等植物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的基本組成部分，利用其生長(zhǎng)發(fā)育狀況來(lái)指示土壤生態(tài)毒性也是土壤污染生態(tài)毒理學(xué)診斷的重要組成部分.雖然各種植物指標(biāo)在生態(tài)毒性指示方面各有優(yōu)勢(shì)，但涉及同種植物各指標(biāo)指示效果對(duì)比，以及不同植物指示之間的一致性分析的研究還比較少.由于通過(guò)不同指示植物對(duì)土壤生態(tài)毒性進(jìn)行指示和評(píng)價(jià)可以有效地集合土壤中不同食物鏈生物對(duì)有毒有害物質(zhì)的整體毒性效應(yīng)，能較為全面地反饋土壤的污染信息.因此，石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程需要整合各種生態(tài)毒性指示和評(píng)價(jià)方法對(duì)土壤系統(tǒng)的生態(tài)安全性做出全面、科學(xué)地判斷.

　　課題組利用前期分離篩選出的3種石油組分降解菌株構(gòu)建了混合菌體系，該混合菌對(duì)石油污染土壤表現(xiàn)出良好的修復(fù)效果.然而，之前的研究尚未確定究竟何種高等植物及具體哪些指標(biāo)能夠敏感地指示微生物修復(fù)的效果;并且在石油污染土壤修復(fù)過(guò)程中，該混合菌對(duì)污染土壤的各種生化指標(biāo)影響的變化規(guī)律尚不清楚.因此，本研究以萵苣、黑麥草、小青菜、小麥、蘿卜為供試植物進(jìn)行高等植物毒性試驗(yàn)，考察石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中土壤的生態(tài)毒性，通過(guò)度量石油污染土壤對(duì)不同高等植物生長(zhǎng)發(fā)育的抑制程度來(lái)考察不同修復(fù)時(shí)期土壤中的生態(tài)毒性強(qiáng)弱及變化規(guī)律，并以此確定石油污染不同高等植物指示的可行性與敏感性.此外，本文從高等植物毒性試驗(yàn)結(jié)果出發(fā)，從生態(tài)學(xué)角度揭示石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中殘留的石油污染物和中間代謝產(chǎn)物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，在證明小麥和蘿卜作為指示植物可行性的同時(shí)，也探究石油污染土壤修復(fù)過(guò)程中污染土壤的各種生化指標(biāo)的變化規(guī)律.

　　2 材料與方法

　　2.1 混合菌的制備

　　課題組前期分離出3種石油烴降解菌株，包括洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)中的烷烴降解菌GS3C，鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)中的菲降解菌GY2B，伯克菌科P and oraea菌屬的pnomenusa種中的芘降解菌GP3B.將上述3種菌株分別取1環(huán)進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后在25 mg · mL-1的原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(磷酸鹽緩沖液5.0 mL，F(xiàn)eCl3水溶液1.0 mL，CaCl2水溶液1.0 mL，MgSO4 水溶液3.0 mL，微量元素溶液1.0 mL，蒸餾水1000 mL)中分別加入1 mL富集液，接著將加入了石油降解菌的原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基置于的搖床中馴化(30 ℃，150 r · min-1)，每5 d為一個(gè)周期，重復(fù)馴化11個(gè)周期后離心分離分別獲取3種馴化產(chǎn)物.最后將馴化后的GS3C、GY2B、GP3B菌(4.0×108 CFU · mL-1)按等量配比的原則(1 ∶ 1 ∶ 1，體積比)復(fù)配后形成石油降解混合菌.

　　2.2 石油污染土壤的制備

　　供試土壤采自廣東增城的水稻田表層土壤.土壤取回經(jīng)干燥處理后過(guò)4.75 mm篩，去除大顆粒物質(zhì)后分為兩份，一份保存于4 ℃黑暗條件下用于測(cè)定新鮮土樣指標(biāo)(表 1)，另一份置于陰涼處風(fēng)干后過(guò)2 mm篩，保存待用.供試石油為廣州石化提供的原油(飽和烴45.55%，芳烴17.69%，膠質(zhì)和瀝青質(zhì)9.68%).

　　表1 供試土壤的理化性質(zhì)

　　在Φ15 cm×20 cm塑料盆裝入3 kg干土，將溶于石油醚中的石油加入土壤中，使土壤中石油烴的初始含量為5000 mg · kg-1(以干土計(jì))并攪拌均勻.接著按每100 g土加3 mL混合菌菌液的比例接種于石油污染土壤中.

　　最后將土壤放置在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行石油污染土壤的生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)，每2 d進(jìn)行一次翻土攪拌并維持土壤含水率的穩(wěn)定.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別采集干凈土壤，生物修復(fù)第0、8、16、24、32、40 d的土壤，分別標(biāo)記為S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6作為不同修復(fù)時(shí)期石油污染土壤，并將其放置在陰涼處風(fēng)干備用.

　　2.3 測(cè)試項(xiàng)目及方法 2.3.1 土壤中總石油烴的提取及含量測(cè)定

　　準(zhǔn)確稱量5 g風(fēng)干土壤，放入50 mL離心管中，加入適量無(wú)水硫酸鈉，添加10 mL正己烷，在1800 r · min-1條件下振蕩1 min，再將其超聲30 min，然后在3000 r · min-1的條件下離心10 min，收集上層液體.重復(fù)上述過(guò)程4次，確保土壤中的石油烴全部被洗出.將上層液體過(guò)0.45 μm的有機(jī)系濾膜后移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮，定容至25 mL，于225 nm處測(cè)定其吸光度值，對(duì)照石油的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出石油污染土樣中石油烴殘留量和表觀降解率η：

　　式中，W1為土樣中石油烴的初始含量，W2為不同處理土樣中石油烴的殘留含量.

　　2.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析

　　用GC-MS(DSQⅡ，美國(guó)熱電)分別對(duì)原油，以及土樣S0、S1、S2、S3、S4、S5和S6中的油分進(jìn)行分析.具體操作條件：進(jìn)樣口、傳輸線和離子源溫度分別為250、280和260 ℃;實(shí)驗(yàn)所采用的載氣為高純氦氣;溶液的進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL;實(shí)驗(yàn)所采用柱子的規(guī)格為30 m×0.32 mm×0.25 μm的HP-5MS石英毛細(xì)管柱.柱子升溫程序的設(shè)置：60 ℃保持5 min，以10 ℃ · min-1的速度升溫至110 ℃，保持2 min，再以2 ℃ · min-1的速度升溫至280℃，保持20 min.質(zhì)譜的掃描范圍：50~550 amu質(zhì)量范圍內(nèi)掃描.2.3.3 幼苗生長(zhǎng)發(fā)育狀況 取萵苣(Asparagus lettuce)、黑麥草(Ryegrass)、小青菜(Brassica chinensis)、大白菜(Chinese cabbage)、小麥(Triticum acstivnm L.)和蘿卜(Raphanus sativus L.)種子(種子均購(gòu)于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)過(guò)發(fā)芽率的預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保種子發(fā)芽率均大于90%)各20粒，將種子均勻播種于事先放有100 g不同修復(fù)時(shí)期石油污染土壤的培養(yǎng)皿中，再在上部均勻覆蓋20 g對(duì)應(yīng)修復(fù)時(shí)期的供試土壤，調(diào)節(jié)土壤含水率至最大持水量的85%，蓋好玻璃培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱(SPX-250，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)中培養(yǎng).培養(yǎng)條件為：在25 ℃條件下，黑暗培養(yǎng)48 h，隨后進(jìn)行16h/8h的光照(光照強(qiáng)度(4300±430)lx)/黑暗循環(huán)培養(yǎng)72 h.種子發(fā)芽后繼續(xù)在16h/8h(晝/夜)的光照(光照強(qiáng)度(4300±430)lx)條件下繼續(xù)培養(yǎng)9 d，共計(jì)14 d后(保持恒溫恒濕條件不變)，測(cè)定不同土壤中小麥和蘿卜的幼苗生長(zhǎng)發(fā)育狀況(株高、地上部鮮重、根鮮重、根干重).

　　2.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量

　　SOD活性測(cè)定：稱取0.5 g鮮葉于預(yù)冷的研缽中，加入一定量石英砂，加入5 mL 0.05 mol · L-1 pH為7.8的磷酸緩沖液，在冰浴中研磨成漿，將漿液轉(zhuǎn)入離心管中，在低溫(4 ℃)超速離心機(jī)(TG16-WS，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)上以10000 r · min-1離心15 min，上清液即為酶粗提液.于4 ℃冰箱中保存，待測(cè).取5支玻璃試管，3支用作測(cè)試樣品，2支為對(duì)照管.按下列要求加入各溶液：4.05 mL 0.05 mol · L-1磷酸緩沖溶液、0.3 mL 200 mmol · L-1 DL甲硫氨基酸溶液、0.3 mL 33 µmol · L-1核黃素溶液、0.3mL 1.25 mmol · L-1 氯化硝基四氮唑溶液、0.05mL酶液，總體積為5 mL，其中2支對(duì)照管所添加的酶液用磷酸緩沖液代替.

　　將上述試劑在玻璃試管中混勻后，把其中1支對(duì)照管置于暗處，其它各管均置于4000 lx日光下反應(yīng)20 min(要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)).最后在560 nm處分別測(cè)定其它各管的吸光度.SOD總活性以每克鮮重酶單位表示，即U · g-1(以FW計(jì))，以抑制氮藍(lán)四唑光化還原至原來(lái)的50%為一個(gè)酶活性單位(U).SOD總活性R按公式(2)計(jì)算：

　　式中，ACK為對(duì)照管的吸光度，AE為樣品管的吸光度，V為樣品液總體積(mL)，VT為測(cè)定時(shí)樣品用量(mL)，W為樣品鮮重(g).

　　丙二醛含量測(cè)定：稱取0.5 g鮮葉于研缽中，加入一定量石英砂，加入5 mL 10%三氯乙酸溶液研磨，將研磨后所得勻漿移至離心管中，在4000 r · min-1下離心10 min，收集上清液，待用.取上述上清液2.0 mL加入帶塞試管中，再向試管中加入2.0 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，混合均勻后，將試管放置于沸水浴中反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻并離心.將上清液分別于450、532和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值.對(duì)照管以2 mL水代替提取液.按公式(3)計(jì)算MDA濃度C(mol · L-1)，得出MDA濃度后，然后以植物組織的鮮重計(jì)算樣品中MDA的含量(公式(4)).實(shí)驗(yàn)所用試劑除正己烷(用于氣相色譜-質(zhì)譜分析)為色譜純外，其它均為分析純，購(gòu)于阿拉丁公司.

　　式中，D為MDA含量(mmol · g-1)，V提為提取液體積(mL)，W3為植物組織鮮重(g).

　　2.4 數(shù)據(jù)處理

　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析、回歸分析及方差分析.

　　3 結(jié)果與討論

 　　3.1 石油污染土壤生物模擬修復(fù)實(shí)驗(yàn)修復(fù)效果

　　不同修復(fù)時(shí)期土壤中總石油烴殘留量及表觀降解率如表 2所示.可以看出，投加菌劑的污染土壤中石油烴表觀降解率遠(yuǎn)高于未投加菌劑的土壤，相應(yīng)地，殘留量遠(yuǎn)低于未投加菌劑的土壤.具體而言，投加菌劑的污染土壤中石油烴表觀降解率隨時(shí)間的推移不斷上升，石油烴表觀降解率在修復(fù)的第8、16、24、32、40 d分別達(dá)到54.0%、57.5%、60.2%、64.1%、64.4%，修復(fù)32 d后石油烴殘留量基本保持穩(wěn)定(約1.79343 mg · g-1).在生物修復(fù)前期，由于油量豐富，石油烴降解菌大量繁殖，石油烴表觀降解率高;隨著時(shí)間的推移，易降解的石油烴組分被大量消耗，殘留物主要為芳香烴等難降解組分，這導(dǎo)致了降解速率的降低和殘留量的相對(duì)穩(wěn)定.同時(shí)可以看到，不投加菌劑的污染土壤中石油烴的表觀降解率隨時(shí)間的延長(zhǎng)有緩慢上升，但降解40 d后只有16.8%的石油烴被去除，其主要原因是土壤中土著微生物對(duì)石油烴的降解及石油烴中易揮發(fā)組分的揮發(fā).與不投加菌劑的污染土壤相比，投加菌劑的污染土壤表現(xiàn)出更高的表觀降解率和更低的殘留量，這表明在該微生物修復(fù)過(guò)程中，石油烴降解菌發(fā)揮了對(duì)污染物的去除的主導(dǎo)作用.

　　表2 不同修復(fù)時(shí)期的土壤中石油烴殘留量及表觀降解率

　　為了更深入地探討石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵問(wèn)題，分別對(duì)修復(fù)結(jié)束后的石油污染土壤中原油各組分(飽和烴、芳烴、瀝青+膠質(zhì))的去除率進(jìn)行了測(cè)定和分析，結(jié)果表明，40 d的修復(fù)期結(jié)束后，烷烴的去除率達(dá)到了66.9%±2.3%，芳烴的去除率為36.6%±3.8%，而石油烴中最難降解的瀝青和膠質(zhì)，它們的去除率為18.5%±3.4%，石油烴組分的去除率高低順序?yàn)椋和闊N>芳烴>瀝青和膠質(zhì).這說(shuō)明微生物對(duì)石油烴各組分的生物利用存在差異.石油中的瀝青質(zhì)和膠質(zhì)進(jìn)入土壤后，由于其粘稠性大和難降解性等特點(diǎn)，在土壤中長(zhǎng)期積累會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和發(fā)育.石油烴組分中的芳香烴是一類具有致癌變、致突變、致畸變等“三致”作用的有毒有害物質(zhì).而恰好相反的是，這兩類石油烴組分在石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中的去除率相對(duì)較低.

　　為進(jìn)一步分析不同修復(fù)時(shí)期的土壤中殘油組分組成，分別對(duì)不同修復(fù)時(shí)期的土樣進(jìn)行了GC-MS分析.不同修復(fù)時(shí)期土樣GC-MS圖譜如圖 1所示.從圖 1可以看出，本研究中構(gòu)建的混合菌體系對(duì)土壤中的石油有明顯的去除效果，并且隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，去除效果更加明顯.對(duì)比原油圖譜(A)和未修復(fù)石油污染土壤(S1)中殘油圖譜可知，這兩幅圖譜的變化不明顯，未修復(fù)石油污染土壤相對(duì)于原油只是在n-C14以下的石油烴有較明顯的去除.引起這部分差別的原因可能主要是由于在配制石油污染土壤的過(guò)程中，該部分石油烴的揮發(fā)所導(dǎo)致.Galin等研究認(rèn)為，石油烴中C15以下的這部分烴類物質(zhì)較易通過(guò)化學(xué)揮發(fā)進(jìn)入空氣，導(dǎo)致空白對(duì)照組的該部分損失.然而，修復(fù)后的土壤GC-MS圖譜表現(xiàn)出明顯差異.污染土壤經(jīng)過(guò)8 d微生物修復(fù)后(土樣S2)，C20以下的直鏈烷烴峰高相對(duì)于C20以上的峰高要明顯低一些.這主要是因?yàn)镃20以下的直鏈烷烴容易被微生物優(yōu)先利用，導(dǎo)致其相對(duì)含量降低;而C20以上的烷烴不易被微生物所利用，所以其含量相對(duì)較高，最終在圖譜表現(xiàn)出來(lái).通過(guò)比較C和D圖譜可知，相對(duì)分子質(zhì)量較高的烴(C>20)含量相對(duì)較低，而C20以下的烷烴含量增加，并且圖譜中峰的數(shù)目也明顯增多.這可能是由于在修復(fù)的中期，易降解烷烴含量降低，微生物為了維持成長(zhǎng)代謝，必須利用碳數(shù)較多的烷烴作為微生物生長(zhǎng)代謝所需的碳源，導(dǎo)致C20以上的烷烴含量減少.同時(shí)，由于微生物的作用，將長(zhǎng)鏈分解成短鏈，導(dǎo)致短鏈數(shù)量和含量增加.從圖譜F(S5)和G(S6)可以看出，土樣S5的修復(fù)效果和土樣S6的修復(fù)效果基本相同.這可能是由于在修復(fù)后期，微生物可利用的碳源減少，加上代謝中間產(chǎn)物的積累，破壞了土壤的原有生態(tài)體系，使得微生物的活性降低，從而影響了石油在土壤中的降解.　

　　圖1 不同修復(fù)階段土樣殘油GC-MS圖譜(A：原油GC-MS圖譜; B~G：土樣S1~S6中殘油GC-MS圖譜)

　　此外，有關(guān)學(xué)者利用“分子化石”抗生物降解的特性來(lái)評(píng)價(jià)石油污染生物修復(fù)的情況.姥鮫烷(Pr，即2，6，10，14-四甲基十五烷)和植烷(Ph，2，6，10，14-四甲基十六烷)是原油中常見(jiàn)的兩種標(biāo)志化合物，其結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，微生物作用一般不影響它們的含量.因此，本研究中采用Pr和Ph這兩種物質(zhì)來(lái)綜合評(píng)價(jià)石油污染土壤的修復(fù)效果.姥鮫烷Pr/nC17、植烷Ph/nC18是衡量微生物降解原油的參數(shù)，常把Pr/nC17和Ph/nC18這兩個(gè)比值作為微生物降解原油因子的重要指標(biāo)，可判別原油降解的程度.Pr/nC17和Ph/nC18的比值增大，說(shuō)明石油污染土壤中正構(gòu)烷烴的含量減少，而異構(gòu)烷烴的含量相對(duì)增多.通過(guò)原油的GC-MS分析可知，土樣S1中，Pr/nC17值為0.526，而40 d的生物修復(fù)以后，其值上升至7.273;同樣，土樣S1中，Ph/nC18值為0.348，生物修復(fù)40 d后上升至6.357.說(shuō)明本研究中石油污染土壤經(jīng)40 d的微生物生物修復(fù)后，污染土壤中的正構(gòu)烷烴得到了有效去除，殘留下來(lái)的是一些生物利用性低的支鏈烷烴類物質(zhì).

　　3.2 萵苣、黑麥草、小青菜幼苗生長(zhǎng)狀況

　　不同修復(fù)時(shí)期的土壤對(duì)萵苣、黑麥草、小青菜不同指標(biāo)的影響如表 3所示.對(duì)萵苣而言(表 3)，其株高在整個(gè)微生物修復(fù)過(guò)程中相對(duì)于S0均不存在顯著性差異;地上部鮮重也僅有土樣S1(111.6%)與S0之間存在顯著性差異;而根鮮重和根干重則是

　　表3 不同修復(fù)時(shí)期的土壤對(duì)萵苣、黑麥草、小青菜不同指標(biāo)的影響

　　在修復(fù)后期表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)，土壤S5、S6與S0之間存在極顯著差異，根鮮重分別為S0的114.3%和127.3%，根干重分別為S0的157.7%和179.5%.顯然，萵苣的株高及地上部鮮重對(duì)石油污染土壤的生態(tài)毒性變化不敏感，不宜作為指示指標(biāo);萵苣的根鮮重和根干重在修復(fù)的前期和中期與S0的差異也不顯著，并不能指示石油污染土壤的生態(tài)毒性在哪個(gè)修復(fù)時(shí)期增強(qiáng)，而只能說(shuō)明在生物修復(fù)后期石油污染土壤的生態(tài)毒性低，另外，不同修復(fù)時(shí)期的根鮮重和根干重的質(zhì)量變化范圍分別在在0.33~0.42 mg和0.048~0.09 mg之間，質(zhì)量較小會(huì)給實(shí)際測(cè)量操作增加難度.因此，萵苣不宜作為石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中生態(tài)毒性強(qiáng)弱的指示植物.

　　對(duì)黑麥草而言(表 3)，其株高僅在土樣S1中與S0存在顯著性差異(為S0的108.2%);其地上部鮮重在整個(gè)修復(fù)時(shí)期都表現(xiàn)為抑制，土樣S4、S5、S6中的地上部鮮重與S0之間存在顯著性差異，分別為S0的82.0%、76.3%、78.0%;其根鮮重與根干重在不同修復(fù)時(shí)期的變化規(guī)律不明顯，在S1、S4、S6中都表現(xiàn)出促進(jìn)，但根鮮重在S5、根干重在S2又表現(xiàn)出抑制.由此可知，黑麥草幼苗的株高、地上鮮重、根鮮重及根干重4個(gè)指標(biāo)對(duì)于石油污染土壤的生態(tài)毒性的指示規(guī)律不一致，且同樣存在根鮮重和根干重質(zhì)量小的問(wèn)題.因此，黑麥草不宜作為石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中生態(tài)毒性強(qiáng)弱的指示植物.

　　對(duì)小青菜而言(表 3)，株高和地上部鮮重在修復(fù)中期表現(xiàn)出顯著的抑制，后期僅地上部鮮重在S6中與S0之間存在顯著性差異(為S0的117.7%);根鮮重及根干重則只是在修復(fù)后期出現(xiàn)極顯著的促進(jìn)，前期和中期變化不明顯.根鮮重和根干重質(zhì)量小的問(wèn)題依然存在，因此，小青菜也不宜作為石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中生態(tài)毒性強(qiáng)弱的指示植物.

　　綜上可知，萵苣、黑麥草、小青菜作為石油污染土壤生物修復(fù)過(guò)程中的指示植物時(shí)存在對(duì)毒性變化不敏感、不同指標(biāo)之間指示結(jié)果不一致及部分指標(biāo)數(shù)值過(guò)小的問(wèn)題，故這3種植物均不宜作為指示植物.

　　3.3 小麥和蘿卜的毒理性試驗(yàn)

　　由于萵苣、黑麥草、小青菜幼苗生長(zhǎng)狀況不能夠很好地指示石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中生態(tài)毒性的變化規(guī)律，故本研究嘗試用典型供試植物小麥和蘿卜來(lái)進(jìn)行植物毒理性試驗(yàn).

　　3.3.1 小麥和蘿卜幼苗生長(zhǎng)狀況

　　小麥幼苗在各修復(fù)時(shí)期土壤中的生長(zhǎng)發(fā)育總體情況如圖 2所示.可以看出，在土樣S1和S2中，無(wú)論是株高還是根重(干重和鮮重)均與其它處理土壤之間存在明顯的差異，與無(wú)污染土壤相比表現(xiàn)出明顯的抑制.從株高和根重這兩個(gè)方面來(lái)看，土樣S1、S4、S5、S6與S0相比均表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用.小麥幼苗生長(zhǎng)發(fā)育各指標(biāo)受不同處理土壤脅迫的響應(yīng)存在差異.在土樣S1和S2中，小麥株高與土樣S0之間存在顯著差異，顯著低于無(wú)污染土壤對(duì)照(p<0.05)，分別為無(wú)污染土壤對(duì)照組的89.4%和87.2%;而土樣S1、S4、S5、S6中小麥株高相對(duì)于無(wú)污染土壤對(duì)照均有不同程度的增加，但均不顯著(p>0.05).小麥地上部鮮重在土樣S1中相對(duì)于對(duì)照組有顯著降低(p<0.05)，為對(duì)照組的81.7%;土樣S2中小麥的地上部鮮重與對(duì)照組間存在極顯著差異(p<0.01)，為對(duì)照組的71.8%，其它修復(fù)階段土壤與對(duì)照組之間均不存在顯著差異(p<0.05).小麥的根鮮重和干重除在土樣S1中與對(duì)照組之間不存在顯著差異外，其它各處理土壤中均與對(duì)照組間存在顯著差異.其中，根鮮重在土樣S2中表現(xiàn)出顯著降低(p<0.05)，為對(duì)照組的86.3%，在土樣S3中表現(xiàn)出極顯著降低(p<0.01)，為對(duì)照組的55.1%;在土樣S4、S5、S6中均表現(xiàn)出顯著增加(p<0.05)，分別為對(duì)照組的121.3%、120.9%和118.8%.根干重在土樣S2和S3土壤中出現(xiàn)顯著降低，在土樣S4、S5、S6中表現(xiàn)出顯著增加(p<0.05).

　　圖2 原油對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響(*和**分別表示與S0土壤處理相比差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01))

　　蘿卜在各處理土壤中生長(zhǎng)發(fā)育的總體情況見(jiàn)圖 3.可以看出，不同修復(fù)時(shí)期土壤中蘿卜幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育狀況存在明顯的差異.從株高和根重(干重和鮮重)來(lái)看，蘿卜在整個(gè)修復(fù)時(shí)期的污染處理土壤中與無(wú)污染土壤對(duì)照組相比均表現(xiàn)出抑制作用.其中，在土樣S2、S3、S4中，抑制作用相對(duì)明顯.蘿卜幼苗株高在土樣S2、S3、S4和S5中與對(duì)照組S0相比均存在顯著降低(p<0.05)，分別為對(duì)照組S0的89.3%、89.8%、91.4%和92.0%.地上部鮮重在整個(gè)修復(fù)時(shí)期污染土壤中均表現(xiàn)出不同程度的抑制，為對(duì)照組的93.1%~98.5%，但除土樣S3、S4與對(duì)照組S0間存在顯著差異外(p<0.05)，其它修復(fù)階段與對(duì)照之間的差異均不明顯(p>0.05).同樣，蘿卜幼苗根鮮重指標(biāo)在各修復(fù)時(shí)期的污染土壤中均表現(xiàn)為抑制，為對(duì)照組的78.5%~91.6%，其中在土樣S4中極顯著低于無(wú)污染對(duì)照S0(p<0.01)，在其它處理土壤中顯著低于對(duì)照組(p<0.05).不同修復(fù)時(shí)期污染土壤中蘿卜幼苗根干重與無(wú)污染土壤對(duì)照組之間差異均不顯著(p>0.05).

　　圖3 原油對(duì)蘿卜幼苗生長(zhǎng)的影響(*和**分別表示與S0土壤處理相比差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01))

　　可以看出，不同生長(zhǎng)指標(biāo)在不同修復(fù)階段土壤中的敏感程度各不相同，不同的植物對(duì)各處理土壤中的污染脅迫響應(yīng)也存在差異.小麥的株高、地上部鮮重、根鮮重及根干重在土樣S2和S3中表現(xiàn)為抑制作用，在其它修復(fù)時(shí)期的污染處理土壤中表現(xiàn)為刺激作用.這可能是由于石油污染物進(jìn)入土壤導(dǎo)致土壤中有機(jī)質(zhì)含量增加，土壤肥力有所增大，并且隨著生物修復(fù)的進(jìn)行，石油烴濃度降低.土壤肥力和石油烴濃度的協(xié)同作用刺激了小麥幼苗各生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的生長(zhǎng).宋玉芳等通過(guò)研究不同濃度的污染物對(duì)高等植物的影響表明，低濃度污染物對(duì)高等植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生刺激作用，高濃度污染物對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用.植物的根系與土壤微生物聯(lián)合作用致使低濃度石油組分對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用，并可將土壤中的石油烴轉(zhuǎn)化成CO2和H2O，為土壤微生物提供能量和碳源;與此同時(shí)，植物可以將部分石油烴通過(guò)木質(zhì)化作用，轉(zhuǎn)化成自身的組成部分，促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育.而蘿卜的各幼苗生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)在不同處理土壤中的響應(yīng)與小麥存在一定的差異.蘿卜的各幼苗生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)在整個(gè)修復(fù)時(shí)期都表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中，株高在土樣S3中的抑制效果達(dá)到最大，地上部鮮重和根鮮重在土樣S4中的抑制作用最為明顯.相對(duì)于小麥而言，蘿卜在本研究中表現(xiàn)出更高的敏感性.同時(shí)，上述結(jié)果也佐證了本研究中不同修復(fù)時(shí)期的土壤均存在一定的生態(tài)毒性，并且土壤的毒性在修復(fù)的第一階段達(dá)到最大.

　　3.3.2 葉片SOD活性及MDA含量

　　不同修復(fù)時(shí)期土壤對(duì)供試植物葉片SOD活性及MDA含量的影響如圖 4所示.可以看出，小麥葉片中的SOD活性在整個(gè)修復(fù)時(shí)期土壤中均表現(xiàn)出刺激作用，為對(duì)照處理的105.5%~131.7%.其中，在土樣S1中顯著高于對(duì)照組S0(p<0.05)，在土樣S2、S3、S4中極顯著高于對(duì)照組S0(p<0.01)，并且在土樣S3中刺激作用達(dá)到最大，為無(wú)污染對(duì)照處理S0的131.7%;在土樣S5和S6中雖然表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，但與對(duì)照組S0之間的差異卻并不顯著.

　　圖4 原油對(duì)植物葉片的SOD活性及MDA含量的影響

　　同樣，蘿卜葉片中SOD活性與小麥的趨勢(shì)大致相同，也是在土樣S3中刺激作用最為明顯.研究表明，植物細(xì)胞在逆境脅迫條件下產(chǎn)生的活性氧自由基會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用.SOD活性的升高有利于自由基的清除，解除其對(duì)植物的毒害作用.這說(shuō)明小麥和蘿卜這兩種植物對(duì)不同修復(fù)時(shí)期的土壤都有一定的抗性.在正常的情況下，植物組織SOD的活性與氧自由基處于動(dòng)態(tài)平衡，葉片中氧自由基含量的增加必然會(huì)導(dǎo)致SOD活性的升高.SOD活性越高說(shuō)明土壤的逆境脅迫越嚴(yán)重，這可以從側(cè)面證明石油污染土壤修復(fù)的前中期生態(tài)毒性有所增強(qiáng).土壤生態(tài)毒性的增強(qiáng)才導(dǎo)致了土壤中逆境脅迫增強(qiáng).

　　不同修復(fù)階段的土壤對(duì)供試植物葉片MDA含量的影響如圖 4所示.可以看出，小麥葉片中MDA含量隨修復(fù)時(shí)期的延長(zhǎng)呈先升后降接著又緩慢回升的變化趨勢(shì).蘿卜葉片中MDA含量在不同修復(fù)時(shí)期的污染土壤中呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)，只是在修復(fù)后期(土樣S5和S6)小麥葉片中MDA含量與對(duì)照處理不存在顯著差異，而蘿卜葉片中MDA含量與對(duì)照處理相比仍然存在顯著降低.生物修復(fù)初始階段(土樣S1)，石油烴濃度最高，在這種逆境下，植物葉片細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧自由基，為了解除活性氧自由基的毒害，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)加劇，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加.在隨后的修復(fù)時(shí)期中，供試植物葉片細(xì)胞的MDA含量呈抑制趨勢(shì)，主要原因可能是SOD活性的增加，導(dǎo)致其酶反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的大量H2O2對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致MDA含量降低.后階段MDA含量緩慢回升可能是由于植物在逆境條件下抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力有限，導(dǎo)致植物細(xì)胞體內(nèi)還是積累了過(guò)剩的活性氧自由基，這些活性氧自由基破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，致使MDA含量再度上升.

　　3.4 微生物修復(fù)石油污染土壤過(guò)程中的生態(tài)毒性

　　石油烴目標(biāo)污染物是評(píng)價(jià)污染土壤修復(fù)效果的一項(xiàng)指標(biāo).然而由于土壤環(huán)境及石油組分的復(fù)雜性，不可能將土壤中所有的有毒有害物質(zhì)都通過(guò)化學(xué)方法得到檢測(cè).土壤環(huán)境本身就是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，一般的化學(xué)方法并不能科學(xué)、全面地評(píng)價(jià)土壤的修復(fù)效果和表征修復(fù)后土壤整體的質(zhì)量特征，并且，在石油污染土壤中，即使石油目標(biāo)污染物的含量達(dá)到環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，但由于難降解組分的殘留和次生代謝產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的存在，土壤的生態(tài)毒性仍然很強(qiáng)，而且在生物體上會(huì)最終表現(xiàn)出來(lái).由于化學(xué)診斷的局限性，單一地采用化學(xué)方法來(lái)診斷和評(píng)價(jià)土壤的修復(fù)效果已經(jīng)不能準(zhǔn)確指示石油污染土壤生態(tài)毒性的強(qiáng)弱.

　　本研究以不同供試植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況及葉片生化指標(biāo)為主要研究對(duì)象對(duì)不同修復(fù)時(shí)期石油污染土壤的生態(tài)毒性進(jìn)行了分析診斷，對(duì)比了不同供試植物作為指示生物的可行性與敏感性，并以此來(lái)評(píng)價(jià)了石油污染土壤微生物的修復(fù)效果.通過(guò)對(duì)比分析可以看出，石油污染土壤生態(tài)毒性隨修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后減弱的變化趨勢(shì).這與采用目標(biāo)污染物的化學(xué)診斷方法存在明顯不同.

　　具體而言，植物各指標(biāo)的響應(yīng)并不是隨著石油烴濃度的變化呈現(xiàn)相應(yīng)的變化趨勢(shì);當(dāng)石油烴濃度最高時(shí)，供試植物幼苗各生長(zhǎng)指標(biāo)的抑制效果不是最明顯;相反，在石油污染土壤修復(fù)過(guò)程的前中期，石油污染土壤的抑制作用最強(qiáng).這說(shuō)明在石油污染土壤的修復(fù)過(guò)程中，目標(biāo)污染物殘留量的減少并不能籠統(tǒng)地說(shuō)土壤的修復(fù)效果好，應(yīng)結(jié)合土壤的生態(tài)學(xué)毒性試驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)土壤的修復(fù)效果和健康質(zhì)量.

　　在石油污染土壤中，即使石油目標(biāo)污染物的含量達(dá)到環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，土壤的生態(tài)毒性仍然很強(qiáng)，而且在生物體上會(huì)最終表現(xiàn)出來(lái).Hubálek等研究表明，盡管石油烴總量修復(fù)后降低了65%，但由指示微生物、陸生植物、水生植物、蚯蚓和甲殼類動(dòng)物的生態(tài)毒性評(píng)價(jià)結(jié)果則顯示為修復(fù)第一階段的生態(tài)毒性最高，而且整個(gè)修復(fù)過(guò)程中土壤均存在一定的毒性效應(yīng).石油污染土壤隨著微生物的修復(fù)其毒性變得復(fù)雜化，在修復(fù)的前中期毒性表現(xiàn)為增強(qiáng)，可能主要是由于：①修復(fù)的前期易降解組分的減少，導(dǎo)致難降解物質(zhì)(如多環(huán)芳烴、瀝青質(zhì)和膠質(zhì))的含量相對(duì)增加，而多環(huán)芳烴等難降解物質(zhì)的毒性要明顯高于烷烴類物質(zhì).②修復(fù)過(guò)程中微生物的代謝中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，導(dǎo)致其毒性要強(qiáng)于原來(lái)的污染物.已有研究表明，某些烴尤其是PAHs的氧化中間產(chǎn)物具有比母本烴更強(qiáng)的生態(tài)毒性.因此，在石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中，應(yīng)對(duì)中間代謝產(chǎn)物給予足夠的重視.隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤的生態(tài)毒性慢慢降低，主要是因?yàn)槲⑸�物開(kāi)始利用多環(huán)芳烴等難降解物質(zhì)作為碳源，導(dǎo)致其含量降低;再者，土壤微生物在土壤環(huán)境中優(yōu)勝劣汰，能夠適應(yīng)土壤新環(huán)境的微生物被保留下來(lái)，它們可以利用中間代謝產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行自身的生長(zhǎng)和繁殖，這些因素的綜合效益使得土壤的生態(tài)毒性隨修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)慢慢地降低.可以看出，石油污染土壤修復(fù)時(shí)間越長(zhǎng)，土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)越小.事實(shí)表明，要想將污染土壤恢復(fù)到土壤原有的生態(tài)功能和狀態(tài)是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜的過(guò)程.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結(jié)論

　　1)自制混合菌株(GS3C、GY2B、GP3B，等量配比)能夠有效地降解石油污染物.

　　2)相對(duì)于萵苣、黑麥草和小青菜，小麥和蘿卜對(duì)石油污染土壤的生態(tài)毒性變化更為敏感，更適合作為指示植物.

　　3)植物的毒性試驗(yàn)中，修復(fù)前期的土壤對(duì)植物的生長(zhǎng)及葉片生化指標(biāo)抑制最為明顯，后期抑制效果減弱.

　　4)在石油污染土壤微生物修復(fù)過(guò)程中，土壤中目標(biāo)污染物量的減少并沒(méi)有導(dǎo)致土壤生態(tài)毒性的降低.石油污染土壤微生物修復(fù)后土壤毒性變的復(fù)雜化.石油污染土壤在整個(gè)生物修復(fù)過(guò)程中均存在一定的生態(tài)毒性，并且在修復(fù)的前中期達(dá)到最大，修復(fù)后期逐漸減弱.