1 引言

　　合成染料廣泛應用于印染、制皮、化妝品、印刷、醫(yī)藥和食品加工等行業(yè)，然而，這些染料大多數(shù)都具有生物毒性和致畸致癌性，而且在自然環(huán)境中極難生物降解，對光、生物酶和其他環(huán)境條件的抵抗力極強.

　　孔雀石綠作為一種三苯甲烷類染料，廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、食品加工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)等各個領(lǐng)域中.隨其廣泛使用，該染料對哺乳動物細胞、水生生物和其他有機生命體的致癌致畸效應也凸現(xiàn)出來，引起了科學界的廣泛關(guān)注.因此，在許多國家和地區(qū)，該染料已被立法嚴禁使用，且被美國食品和藥物管理局列為致癌性測試的優(yōu)先化學物質(zhì)之一.然而，由于孔雀石綠的生產(chǎn)成本較低、穩(wěn)定性強且使用效果較好，難以找到合適的替代物，導致很多地區(qū)仍在廣泛使用該染料，嚴重破壞了使用地區(qū)的生態(tài)平衡盡管許多科學工作者已致力于解決由孔雀石綠造成的環(huán)境污染問題，例如應用吸附、化學沉淀、光降解、滲透和膜過濾等理化處理技術(shù)處理污染水源;然而，由于這些處理方法不僅處理費用高、效率不高，而且在治污的同時容易產(chǎn)生二次污染和難以處置的底泥，因此，極大地限制了其廣泛推廣使用.生物處理技術(shù)作為一種環(huán)境友好型且高效低耗的處理手段受到越來越廣泛的關(guān)注.其中，細菌由于生長速度快，容易獲得大量生物量，且易產(chǎn)生大量降解相關(guān)酶，對染料的降解效率也較高等優(yōu)勢而受到環(huán)境工作者的青睞.

　　本研究的目的在于：①廣泛篩選浙南地區(qū)的MG高效脫色菌株;②初步鑒定MG高效脫色菌株為DH-9;③采用單因素實驗研究菌株DH-9對MG的脫色特性，并采用響應面設計優(yōu)化脫色條件.

　　2 材料與方法

　　2.1 實驗材料 2.1.1 菌種來源

　　供試土樣取自浙江溫州雙嶼皮革城和溫州大羅山果園，菌株DH-9來源于常年被皮革廢水污染的污泥中.

　　2.1.2 試劑

　　孔雀石綠屬于三苯甲烷類染料，購自國藥集團化學試劑有限公司;革蘭氏染色液;TE緩沖液;Tris飽和酚(pH 8.0);氯仿;10×PCR緩沖液、DNA 連接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司);DNA 純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)等.其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純.

　　2.1.3 培養(yǎng)基

　　無機鹽培養(yǎng)基(MSM)組成(g · L-1)：Na2HPO4，15.13;KH2PO4，3.0;NaCl，0.5;NH4Cl，1.0;MgSO4 · 7H2O，0.491;CaCl2 · 2H2O，0.026;pH 7.0.LB培養(yǎng)基組成(g · L-1)：蛋白胨，10;酵母膏，5;NaCl，10;pH 7.0~7.2.純化培養(yǎng)基組成(g · L-1)：在MSM培養(yǎng)基中添加終濃度為200 mg · L-1的MG染料.

　　2.2 實驗儀器

　　超凈工作臺;電熱恒溫鼓風干燥箱;高壓蒸汽滅菌鍋;全溫恒溫搖床;電子天平;pH計;高速冷凍離心機;Evolution 260紫外可見光分光光度計;Bio-rad PCR儀、自動凝膠圖像分析儀及水平電泳儀等.

　　2.3 實驗方法 2.3.1 MG高效脫色菌株的富集、分離和純化方法

　　將1.0 g土樣接入已滅菌的含100 mL MSM培養(yǎng)基的三角瓶中，同時在MSM培養(yǎng)基中添加已過濾除菌的MG母液作為唯一碳源，使其終濃度為20 mg · L-1.將三角瓶置于30 ℃、180 r · min-1搖床中振蕩培養(yǎng)1周后，吸取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基(含40 mg · L-1的染料)中，連續(xù)馴化、富集.轉(zhuǎn)接多次后，培養(yǎng)物可耐受的染料終濃度為200 mg · L-1.用接種環(huán)蘸取少許富集培養(yǎng)液，在純化培養(yǎng)基平板上直接劃線分離.在平板上選擇不同形態(tài)特征的單菌落，重新轉(zhuǎn)接至含200 mg · L-1 MG的純化培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)接多次直至獲得單一形態(tài)的MG脫色菌純培養(yǎng)物.

　　2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR擴增與序列分析

　　(1)提取基因組DNA：采用酚-氯仿法抽提基因組DNA，具體步驟參考《分子克隆實驗指南》.

　　(2)16S rRNA基因PCR反應：用于菌株DH-9 16S rRNA基因PCR反應的引物為一對通用引物，正向引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′;反向引物BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3，PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海生工生物工程有限責任公司完成.所得序列用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中的菌株進行比對，選取一些具有代表性的菌株用于系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建.采用軟件CLUSTAL X 1.8.3進行DNA序列同源性比較.比對結(jié)果用MEGA 4.1軟件中的Neighbor-Joining的距離模進行UPGA分析后生成系統(tǒng)發(fā)育樹.

　　2.3.3 菌株DH-9對MG的脫色特性研究

　　(1)培養(yǎng)基起始pH值對MG脫色的影響：用1.0 mol · L-1的HCl或NaOH將2.0 g · L-1酵母粉溶液的初始pH值分別調(diào)整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.滅菌后添加過濾除菌的MG，使MG終濃度為100 mg · L-1，接種等量菌株DH-9過夜培養(yǎng)物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng).

　　(2)培養(yǎng)溫度對MG脫色的影響：分別設定培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35和40 ℃.在2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加過濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，接種等量菌株DH-9過夜培養(yǎng)物(2%，V∶V)，并于180 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng).

　　(3)接種量對MG脫色的影響：在2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加過濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，分別接種1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%(V：V)的菌株DH-9過夜培養(yǎng)物，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng).

　　(4)碳氮源對染料脫色的影響實驗：將所選碳源(葡萄糖、麥芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖和蔗糖)分別添加至MSM培養(yǎng)基中，使其終濃度為2.0 g · L-1.將所選氮源(NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸)分別添加至無NH4Cl的MSM培養(yǎng)基中，使其終濃度為2.0 g · L-1.滅菌后添加過濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，接種等量菌株DH-9過夜培養(yǎng)物(2%，V∶V)，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng)(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).

　　(5)金屬離子對MG脫色的影響：分別向2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加終濃度為1.0和2.0 mmol · L-1的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，滅菌后添加過濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，接種等量菌株DH-9過夜培養(yǎng)物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng)(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).

　　所有實驗均重復3次以上，并同時設置對照實驗.

　　2.3.4 響應面設計優(yōu)化菌株DH-9對MG的脫色條件

　　在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗設計(Central Composite Design，CCD)對MG脫色條件進行優(yōu)化，培養(yǎng)8 h后測定其脫色率.用標準多項式回歸方法，對CCD設計實驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到一個二次多項式：

　　式(1)中，Y為預測目標函數(shù);β0為常數(shù);βi為線性系數(shù);βii為平方系數(shù);βij為交互作用系數(shù).本實驗采用五因素三水平CCD設計來研究操作參數(shù)對MG脫色的影響，具體設計如表 1所示.

 

　　2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

　　CCD實驗設計數(shù)據(jù)采用Minitab 14.0軟件進行統(tǒng)計分析.

　　3 結(jié)果與分析 3.1 MG高效脫色菌株的篩選與鑒定

　　經(jīng)多次富集、純化培養(yǎng)后，獲得了多株對MG有一定脫色能力的菌株，其中菌株DH-9對MG的脫色效果最好，同時，全波長掃描結(jié)果顯示脫色后有新的吸收峰產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未給出)，加之脫色后菌體沉淀呈現(xiàn)無色，推測該菌株對MG的脫色可能是由生物降解引起的.因此，隨后著重對菌株DH-9進行了鑒定.

　　革蘭氏染色結(jié)果顯示菌株DH-9是革蘭氏陰性菌，短桿狀.菌落呈現(xiàn)圓形，乳白色，半透明，表面光滑濕潤.

　　以菌株DH-9基因組為模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20進行PCR擴增，檢測PCR產(chǎn)物、回收、純化后測序，獲得1475 nt的DH-9菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登錄序號為KC736654.該序列經(jīng)與GenBank中的數(shù)據(jù)比對后發(fā)現(xiàn)，其相似度與Enterobacter aerogenes strain ATCC 13048的相似度達到98%以上，并且在系統(tǒng)進化樹中也與該菌株聚類在一起(圖未給出)，表明菌株DH-9屬于腸桿菌屬.

　　3.2 菌株DH-9對MG的脫色特性 3.2.1 pH值和溫度對MG脫色的影響

　　培養(yǎng)基初始pH值對MG脫色影響的結(jié)果如圖 1a所示.培養(yǎng)12 h時，pH值在4.0~9.0之間的MG培養(yǎng)基脫色率在90%以上.培養(yǎng)24 h以后，pH值在3.0~9.0之間的MG培養(yǎng)基脫色率均在90%以上，說明該菌株對MG脫色的pH適應性較強，實際應用潛力較大.

　　圖 1

　　圖 1 pH(a)和溫度(b)對MG脫色的影響

　　溫度對MG脫色的影響結(jié)果如圖 1b所示.由圖可知，培養(yǎng)12 h時，溫度為30~40 ℃間的MG脫色率在90%以上.隨著脫色時間的延長，當培養(yǎng)時間超過24 h后，所測溫度范圍內(nèi)(15~40 ℃)的MG脫色率均超過90%，表明該菌株對MG脫色的最適溫度范圍為30~40 ℃，溫度適應性較好.

　　碳氮源對MG脫色的影響如圖 2a、圖 2b所示.實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)48 h以內(nèi)時，多數(shù)所測試碳源對MG脫色有抑制效應或無顯著影響;而當培養(yǎng)時間超過72 h后，多數(shù)所測試碳源對MG脫色有促進作用，其中以乳糖、半乳糖和果糖促進效果最為顯著，總體而言，所測試碳源中以半乳糖對MG脫色的促進效果最好.與碳源相比，多數(shù)所測試氮源對MG脫色的促進效果優(yōu)于碳源，實驗中所測試的氮源均能顯著促進MG脫色.有機氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和谷氨酸)比無機氮源(NH4Cl和NaNO3)的促進效果要好，其中尤以酵母粉、谷氨酸和甘氨酸的促進效果最好.

　　圖 2

　　圖 2 碳(a)、氮(b)源和金屬離子(c)對MG脫色的影響 (1.1.0 mmol · L-1氯化銅; 2.2.0 mmol · L-1氯化銅; 3.1.0 mmol · L-1氯化鐵; 4.2.0 mmo · L-1氯化鐵; 5.1.0 mmol · L-1氯化鈣; 6.2.0 mmol · L-1氯化鈣; 7.1.0 mmol · L-1氯化鋅; 8.2.0 mmol · L-1氯化鋅; 9.1.0 mmol · L-1氯化鎂; 10.2.0 mmol · L-1氯化鎂; 11.1.0 mmol · L-1氯化錳; 12.1.0 mmol · L-1氯化錳) Fig. 2 The effect of carbon(a)，nitrogen(b)resources and metal ions(c)on MG decolorization(1.1.0 mmol · L-1 CuCl2; 2.2.0 mmol · L-1 CuCl2; 3.1.0 mmol · L-1 FeCl3; 4.2.0 mmol · L-1 FeCl3; 5.1.0 mmol · L-1 CaCl2; 6.2.0 mmol · L-1 CaCl2; 7.1.0 mmol · L-1 ZnCl2; 8.2.0 mmol · L-1 ZnCl2; 9.1.0 mmol · L-1 MgCl2; 10.2.0 mmol · L-1 MgCl2; 11.1.0 mmol · L-1 MnCl2; 12.1.0 mmol · L-1MnCl2)

　　金屬離子對MG脫色的影響如圖 2c所示.由圖可知，大多數(shù)所測試金屬離子對MG脫色沒有顯著效應，僅Cu2+和Fe3+對MG脫色有顯著抑制效應，鈣離子對脫色有微弱促進效應.

　　3.2.3 接種量對MG脫色的影響

　　接種量對MG脫色的影響結(jié)果如圖 3所示.當接種量從1%上升至3%時，MG脫色率上升趨勢顯著;而當接種量繼續(xù)增大時，MG脫色率變化趨勢則趨于平穩(wěn)，均維持在90%以上.

　　圖 3

　　圖 3 接種量對MG脫色的影響

　　3.3 菌株DH-9對MG的最優(yōu)脫色條件 3.3.1 回歸方程和預測模型的構(gòu)建

　　采用CCD設計優(yōu)化MG的脫色條件和研究主效應因子間的交互作用，實驗結(jié)果和模型預測結(jié)果如表 1所示.實驗所得培養(yǎng)8 h后的孔雀石綠的脫色率分布在78.0%~99.2%之間，說明主效應因子對MG脫色影響顯著.MG脫色率的實驗值和預測值基本保持一致，說明所獲得模型精確性較高.所獲得模型的回歸系數(shù)和統(tǒng)計學分析(ANOVA)結(jié)果如表 2和表 3所示.結(jié)果顯示，模型的決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)(adjusted R2)分別為99.7%和99.2%，這就說明該模型精確性較高，可以用于MG脫色率的預測.因此，適于預測MG脫色率的二次模型公式可表示如下：

　　式(2)中，DP是MG的脫色率，A到D是CCD設計的5個自變量，分別為pH、溫度、半乳糖、酵母粉和氯化鈣濃度.回歸分析的F值和p值分別為201.26和<0.001，這說明該模型的顯著性較高.線性和交互作用選項的p值也<0.001，這說明線性選項和交互作用選項AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE對MG脫色的影響顯著.此外，“l(fā)ack of Fit”選項的F值和p值分別為4.57和0.058，說明相對于純誤差“l(fā)ack of Fit”不顯著，進而說明該模型與響應值(MG的脫色率)的擬合效果較好.

  

　　3.3.2 主效應因子間的相互作用

　　用Minitab 14.0軟件分析獲得的因素間交互作用的2D圖如圖 4～6所示.圖 4顯示了pH和半乳糖、酵母粉、氯化鈣濃度之間的交互作用及其對脫色的聯(lián)合影響，結(jié)果表明pH和這3種因素之間的交互作用顯著.如圖所示，隨著pH值逐漸升高，脫色率隨半乳糖和酵母粉濃度的升高而逐漸降低，但其隨氯化鈣濃度的升高則呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢.

　　圖 4

　　圖 4 pH和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化鈣(c)濃度對MG脫色的影響

　　圖 5顯示了溫度和半乳糖、酵母粉、氯化鈣濃度之間的交互作用及其對脫色的聯(lián)合影響，結(jié)果表明溫度和這3種因素之間的交互作用顯著.由圖可知，隨著溫度逐漸升高，脫色率隨半乳糖和酵母粉濃度的升高而逐漸降低，但其隨氯化鈣濃度的升高則呈現(xiàn)出先降低再升高的趨勢.

　　圖 5

　　圖 5 溫度和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化鈣(c)濃度對MG脫色的影響

　　圖 6顯示了半乳糖濃度和酵母粉、氯化鈣濃度之間以及酵母粉濃度和氯化鈣濃度之間的顯著的交互作用及其對脫色的聯(lián)合影響.圖 6a和6b表明隨著半乳糖濃度的逐漸升高，脫色率隨酵母粉和氯化鈣濃度的升高而呈現(xiàn)降低趨勢.由圖 6c可知，隨著酵母粉濃度的逐漸升高，脫色率隨氯化鈣濃度的升高也呈現(xiàn)降低趨勢.

　　圖 6

　　圖 6 半乳糖和酵母粉(a)、氯化鈣(b)及酵母粉和氯化鈣(c)濃度對MG脫色的影響

　　3.3.3 預測模型的驗證

　　為了確定CCD實驗所獲得二次模型的精確性，我們進行了驗證實驗.由軟件分析獲得的最優(yōu)操作參數(shù)如下：pH值為6.0，半乳糖、酵母粉和氯化鈣濃度分別為1.0 g · L-1、1.0 g · L-1和3.0 mmol · L-1，培養(yǎng)溫度為34.5 ℃.在此條件下進行的驗證實驗結(jié)果表明孔雀石綠的最高脫色率為99.4%，在置信范圍(100%±1%)區(qū)間內(nèi)，因此，該模型對響應值的擬合效應較好.具體參見污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 討論

　　孔雀石綠在自然環(huán)境中難以自然降解，且該染料具有致癌致畸性，已引起廣大環(huán)境工作者的廣泛關(guān)注.以往的研究顯示，很多微生物被從環(huán)境中分離出來，測試其對孔雀石綠的脫色行為，如Parshetti et al.(2006)研究了靜止兼氧條件下，Kocuria rosea MTCC 1532菌株對MG的脫色，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當MG初始濃度為50 mg · L-1、接種量為10%(V：V)時，其培養(yǎng)5 h后的脫色率可達到100%，而當MG的初始濃度提高到70 mg · L-1和100 mg · L-1時，其脫色率分別僅為13%和6%;Daneshvar et al.(2007)應用微藻Chlorella sp.進行了類似的實驗，實驗結(jié)果顯示，該微藻僅在MG濃度為10 mg · L-1以下、接種量為9×106 cells · mL-1時，培養(yǎng)2.5 h后的脫色效果較好(脫色率可達80.7%);Ayed et al.(2009)也分離出了一株MG脫色菌，經(jīng)其研究發(fā)現(xiàn)，在搖動狀態(tài)下、接種量為14×107 cells · mL-1，該菌對50 mg · L-1的MG的4 h脫色率可達75%.已分離的菌株對孔雀石綠的脫色行為各異，但總體而言，脫色效率仍差強人意.與以往這些報道相比較，菌株DH-9在好氧條件下，當接種量為3%(V：V，菌體干重約0.23 g · L-1)時，對100 mg · L-1 的MG 8 h脫色率可達99.4%，脫色效果較好.

　　實際染料廢水處理過程中，環(huán)境因素很難控制，進而導致處理效率不高.以往的研究結(jié)果表明，溫度和pH等環(huán)境因子對多數(shù)菌株的染料脫色能力影響顯著(Khan et al., 2013).例如，Jung et al.(2013)的研究表明Pseudomonas sp. MGO僅在pH 5~7的范圍內(nèi)對MG有較高的脫色率，而當pH<5和pH>7時，MG脫色率則不足20%;同樣，Shedbalkar et al.(2011)和Kalyani et al.(2012)的報道中也指出pH和溫度等環(huán)境因子會顯著影響脫色菌株對MG的脫色能力.相比而言，本研究中菌株DH-9在pH3.0~9.0之間及溫度范圍為15~40 ℃時，培養(yǎng)24 h后，MG 的脫色率均可達到90%以上，說明該菌株對pH和溫度的適應性較強，進而表明該菌株的實際應用潛能較為廣闊.

　　5 結(jié)論

　　1)通過自然界中的優(yōu)勢菌種強化處理泄漏至水環(huán)境中的有毒害染料是國際上的研究熱點之一.本研究從浙江溫州分離篩選到1株孔雀石綠高效脫色菌株Enterabacter sp. DH-9，其pH(3.0~9.0)和溫度(15~40 ℃)適應性都較強，培養(yǎng)24 h后的脫色率可達90%以上;且多數(shù)金屬離子對其脫色都沒有顯著的影響，說明其實際應用潛力較大.

　　2)通過響應面設計獲得了該菌株脫色孔雀石綠的最優(yōu)操作條件為：pH 6.0、1.0 g · L-1的半乳糖、1.0 g · L-1的酵母粉、3.0 mmol · L-1的氯化鈣以及培養(yǎng)溫度為34.5 ℃，并構(gòu)建了適于預測孔雀石綠脫色率的二次模型公式.進一步的研究將以該菌株脫色孔雀石綠的機理和其實際應用為中心，開展更加深入的探索.