由于抗生素過量使用造成的細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)以及耐藥機(jī)制多樣化正對(duì)當(dāng)前整個(gè)世界范圍內(nèi)的公共健康造成深刻影響. 我國(guó)部分地表水源和地下水源已受到抗生素和抗生素耐藥基因的污染，受抗生素污染水環(huán)境已成為微生物獲得和傳播耐藥性的理想場(chǎng)所. 水環(huán)境中的抗生素、 耐藥基因和攜帶耐藥基因的微生物能穿透?jìng)鹘y(tǒng)凈水工藝進(jìn)入配水系統(tǒng). 人類飲水健康面臨巨大風(fēng)險(xiǎn).

　　有研究表明，抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes,ARGs)可以在環(huán)境中持續(xù)性殘留，并且可通過基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制與質(zhì)粒、 轉(zhuǎn)座子、 整合子等可移動(dòng)基因元件結(jié)合，在種間甚至屬間進(jìn)行遷移. 因此，ARGs在環(huán)境中的遷移、 轉(zhuǎn)化和傳播比抗生素殘留本身對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害更大. 自2006年P(guān)ruden等[15]將ARGs作為一種新型的環(huán)境污染物提出后，國(guó)內(nèi)外有關(guān)其在各種介質(zhì)中傳播和污染的研究與報(bào)道日益增多. Xi等研究表明在飲用水中可以檢測(cè)到耐藥細(xì)菌(antibiotic resistant bacteria,ARB)及耐藥基因的存在，可能對(duì)人類及動(dòng)物健康具有潛在風(fēng)險(xiǎn). Farkas等研究表明整合子家族存在于凈水工藝中，且生物膜可作為其傳播媒介. Xu等通過高通量q-PCR技術(shù)使用285種不同耐藥基因檢測(cè)浙江某凈水工藝對(duì)耐藥基因的影響，結(jié)果表明耐藥基因在凈水工藝中大量存在并受凈水工藝影響. 梁惜梅等研究結(jié)果表明int1相對(duì)含量和ARGs總量之間存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，int1在ARGs的水平傳播中起著非常重要的作用. 本實(shí)驗(yàn)室研究表明在經(jīng)過生物活性炭濾池后，可培養(yǎng)微生物的耐藥率會(huì)出現(xiàn)明顯增強(qiáng). 目前，有關(guān)凈水工藝過程中耐藥細(xì)菌的多重耐藥性研究甚少. 本研究選取氨芐青霉素(Amp)、 卡那霉素(Kan)、 利福平(Rif)、 氯霉素(Cm)以及鏈霉素(Str)這5種抗生素，通過分離鑒定的可培養(yǎng)微生物的多重耐藥性，探究?jī)羲�工藝�?duì)可培養(yǎng)微生物多重耐藥能力的影響. 通過檢測(cè)3種整合子(Integron)、 9種轉(zhuǎn)座子(Transposon)絕對(duì)含量隨工藝變化規(guī)律，探討凈水工藝對(duì)基因水平轉(zhuǎn)移元件的影響和耐藥基因在凈水工藝過程中發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制.

　　1 材料與方法

        1.1 樣品的采集與處理

　　以上海黃浦江水源某水廠供水系統(tǒng)為研究對(duì)象，其凈水工藝包括原水、 絮凝沉淀、 臭氧生物活性炭過濾、 砂濾、 氯胺消毒. 在原水、 每個(gè)單元工藝后及用戶龍頭處設(shè)置采樣點(diǎn)，使用已滅菌的容器進(jìn)行取樣，取樣體積為10 L，樣品采集時(shí)間為2015年5月.

　　1.2 微生物的分離、 純化與鑒定

　　將采集水樣使用 0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行抽濾濃縮，然后將濾膜剪碎投入 50 mL離心管中,使用10 mL PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，渦旋振蕩 15 min.

　　(1) 使用普通無抗生素R2A平板，接種涂布上述振蕩后水樣1 mL，28℃培養(yǎng)7 d.

　　(2) 根據(jù)細(xì)菌菌落是否凸起、 是否透明、 邊緣是否光滑等菌落特征挑取優(yōu)勢(shì)菌株，多次劃線后獲得純培養(yǎng).

　　(3) 純化后的菌株置于滅菌的R2A液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28℃，200 r·min-1于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h. 在其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取菌液5 mL，使用天根基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，使用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA基因序列. PCR擴(kuò)增體系為50μL，其中10×Taq buffer 5μL，dNTPs 4μL，引物各1.5μL(10 mmol·L-1),Taq酶 1.0μL，模版100 ng左右，超純水補(bǔ)齊. 擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 400 bp. PCR反應(yīng)條件為95℃: 5 min;95℃:30 s; 56℃:30 s; 72℃: 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司檢測(cè)，將測(cè)序結(jié)果在NCBI-Blast 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì).

　　1.3 飲用水凈水工藝中細(xì)菌耐藥性分析

　　分別使用Amp、 Kan、 Cm、 Rif、 Str這5種抗生素配制濃度為1、 2、 5、 8、 10和15μg·mL-1的R2A培養(yǎng)基，倒平板，常溫下過夜. 分別接種涂布飲用水中分離純化菌株和振蕩后的水樣，28℃培養(yǎng)7d. 根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果分析微生物多重耐藥性及飲用水凈水工藝對(duì)選擇菌株耐藥性隨抗生素濃度變化.

　　1.4 環(huán)境樣品中微生物基因組DNA提取

　　將上述濃縮后的濾膜，使用SDS法提取環(huán)境樣品中微生物基因組DNA，使用NanoDrop 2000(NanoDrop Technologies，Wilmington,DE) 檢測(cè)DNA含量及純度(A260/A280值在1.8～2.0之間). 使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，DNA條帶單一無明顯拖尾，表明用該方法提取的DNA 純度較高.

　　1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)3種整合子及9種轉(zhuǎn)座子進(jìn)行檢測(cè)

　　采用SmartChip Real-time PCR System為高通量熒光定量反應(yīng)平臺(tái). 熒光定量試劑為 FastStart Universal SYBR Green Master (Roche)，PCR反應(yīng)體系為10 μL: Roche FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 5 μL，超純水3μL，DNA模版 0.5μL，引物各0.75μL(1 mmol·L-1). 實(shí)驗(yàn)所選取的引物為3種整合子基因(intI1、 int2、 int1)和9種轉(zhuǎn)座子基因(tnpA-ISEcp1B、 tnpA-IS61、 tnpA-IS62、 tnpA-IS63、 tnpA-IS64、 tnpA-IS4、 tnpA-IS21、 IS613、 Tp614)，檢測(cè)可移動(dòng)基因元件在不同工藝單元水樣中的濃度.

　　定量PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，程序自動(dòng)升溫進(jìn)行溶解曲線分析.

　　2 結(jié)果與討論

        2.1 凈水工藝對(duì)飲用水中可培養(yǎng)微生物多樣性影響

　　本研究從凈水工藝中分離純化出 48株菌，綜合分析菌落菌絲形態(tài)特征以及 16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果，在經(jīng)過比對(duì)分析后，各菌株鑒定結(jié)果如表 1.

　　表 1 凈水工藝中菌株分離鑒定結(jié)果 　　　　

       其中在不同的凈水工藝單元中可培養(yǎng)微生物種類如圖 1所示. 經(jīng)分離鑒定得到26株菌，屬于16個(gè)屬. 其中芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、 噬纖維菌屬(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)在所有的樣品中都能檢測(cè)到，也反映這3個(gè)屬的細(xì)菌對(duì)凈水工藝過程較強(qiáng)的適應(yīng)性. 在原水中可培養(yǎng)微生物最高為11種，其中共球藻屬(Trebouxia aggregata sp.)、 鼠球菌屬(Muricoccus sp.)、 黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)只在原水中分離得到，也說明它們受到凈水工藝過程各種氧化工藝的影響顯著。

圖 1 凈水工藝對(duì)飲用水中可培養(yǎng)微生物多樣性的影響

　　經(jīng)過絮凝沉淀之后，共分離得到6種菌，其中彎曲桿菌(Flectobacillus roses sp.)只在沉淀后能夠分離到. 而經(jīng)過活性炭濾池之后可培養(yǎng)微生物的種類又增多為9種. 當(dāng)在砂濾池投加氯胺消毒劑后，可培養(yǎng)微生物的種類為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、 鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)和噬纖維菌屬(Arcicella rosea sp.). 在分離鑒定的可培養(yǎng)微生物中，鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)被證明具有較強(qiáng)的抗氧化能力，而芽孢桿菌屬的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種在自然界中廣泛分布的好氧、 中溫、 產(chǎn)芽孢的桿菌，是食品和化妝品中常見的污染菌. 在經(jīng)過氯消毒之后，微生物的存活可能與某些抗氧化機(jī)制有關(guān)，如具有硫修飾的DNA可作為一種抗氧化劑保護(hù)DNA. 從出廠水到用戶龍頭水可培養(yǎng)微生物的多樣性增加.

　　2.2 飲用水中可培養(yǎng)微生物的耐藥性分析

　　對(duì)龍頭水中可培養(yǎng)微生物的多重耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，如圖 2. 結(jié)果表明，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的耐藥能力最強(qiáng). 隨著5種不同抗生素濃度由1 μg·mL-1增加到15μg·mL-1，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)對(duì)5種抗生素始終都具有抗性. 噬纖維菌屬(Arcicella rosea sp.)在1~8μg·mL-1的抗生素濃度條件下可抗5種抗生素，當(dāng)抗生素濃度增加到10 μg·mL-1時(shí)，對(duì)Rif不再具有耐藥能力. 鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)在1~2 μg·mL-1抗生素濃度條件下可以抗5種抗生素，在15μg·mL-1時(shí)只對(duì)Amp具有抗性. 結(jié)合圖 1，可以發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)種屬的細(xì)菌抗氧化能力也較強(qiáng). 已有研究表明抗氯能力強(qiáng)的微生物耐藥能力也較強(qiáng). 除了上述3種細(xì)菌，其它種類細(xì)菌的耐藥能力隨著抗生素濃度的增加不斷減弱.

圖 2 不同耐藥細(xì)菌的多重耐藥能力

　　2.3 凈水工藝過程對(duì)飲用水中耐藥細(xì)菌耐藥能力的影響

　　根據(jù)圖 1和圖 2，選擇凈水工藝中普遍存在且耐藥性較強(qiáng)的3種菌株[芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、 噬纖維菌屬(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)]研究?jī)羲�工藝�?duì)飲用水中耐藥細(xì)菌耐藥能力的影響. 由圖 3所示，飲用水凈水工藝對(duì) 芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、 噬纖維菌屬(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)這3個(gè)屬的細(xì)菌耐藥能力有明顯影響. 隨著抗生素濃度提高，對(duì)3種耐藥細(xì)菌的選擇壓力逐漸增強(qiáng)，3種細(xì)菌的多重耐藥能力先后受到凈水工藝的影響. 但這種影響都有一個(gè)共同特點(diǎn): 每當(dāng)經(jīng)過原水、 預(yù)臭氧和沉淀工藝多重耐藥能力受到影響后，經(jīng)過生物活性炭濾池，3種細(xì)菌的多重耐藥能力又得到恢復(fù)或增強(qiáng). 說明生物活性炭濾池對(duì)細(xì)菌多重耐藥能力具有恢復(fù)或促進(jìn)作用. 分析認(rèn)為，這主要是由于生物活性炭表面生長(zhǎng)大量微生物，可能通過基因水平轉(zhuǎn)移等途徑對(duì)細(xì)菌的多重耐藥能力產(chǎn)生影響. 同時(shí)，由圖 3還可以發(fā)現(xiàn)，在高濃度抗生素水平條件下，3種微生物的多重耐藥能力在龍頭水中相對(duì)于其它凈水工藝單元更強(qiáng)，說明管網(wǎng)輸配系統(tǒng)對(duì)龍頭水樣品中耐藥細(xì)菌的多重耐藥能力恢復(fù)具有明顯的增強(qiáng)作用. 分析認(rèn)為，應(yīng)當(dāng)是管網(wǎng)輸配系統(tǒng)內(nèi)壁表面普遍存在的生物膜發(fā)揮了重要作用. 管網(wǎng)生物膜較大的微生物密度可促進(jìn)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，使耐藥細(xì)菌的多重耐藥能力得以部分恢復(fù).

圖 3 凈水工藝對(duì)飲用水中耐藥細(xì)菌耐藥能力的影響

　　2.4 凈水工藝過程對(duì)飲用水中可移動(dòng)基因元件的影響

　　圖 4為可移動(dòng)基因元件(轉(zhuǎn)座子和整合子基因)在凈水工藝中的絕對(duì)濃度變化規(guī)律. 本研究中各工藝單元出水的轉(zhuǎn)座子絕對(duì)濃度變化規(guī)律為: 生物活性炭濾池>原水>砂濾后>龍頭水>水廠出水[圖 4(a)]，經(jīng)過生物活性炭濾池后可移動(dòng)基因元件絕對(duì)濃度有明顯增加，由1.29E+11 copies·L-1增加至2.14E+11 copies·L-1，其絕對(duì)濃度超過原水. 整合子絕對(duì)濃度變化規(guī)律為: 生物活性炭>原水>砂濾后>龍頭水>水廠出水[圖 4(b)]，經(jīng)過生物活性炭濾池后可移動(dòng)基因元件絕對(duì)濃度有明顯增加，由4.00E+10 copies·L-1增加至7.35E+11 copies·L-1.

　　圖 4 凈水工藝過程中可移動(dòng)基因元件的變化規(guī)律

(a)轉(zhuǎn)座子的絕對(duì)濃度;(b)整合子的絕對(duì)濃度

　　已有研究證實(shí)四環(huán)素類耐藥基因，如tetM、 tetW、 tetQ等經(jīng)常在轉(zhuǎn)座子和其它種類可移動(dòng)基因元件中檢測(cè)到. Sull基因也被發(fā)現(xiàn)位于IncN質(zhì)粒中，這些IncN質(zhì)粒同樣在臨床樣品中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為與人類健康有一定的關(guān)聯(lián)性. 這些與可移動(dòng)基因元件結(jié)合起來的耐藥基因可以通過基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制在種間傳播，造成耐藥基因的擴(kuò)散和在不同環(huán)境中的持久性，同時(shí)也可能導(dǎo)致這些耐藥基因在凈水工藝過程中的行為特征變化.

　　整合子和轉(zhuǎn)座子基因可促使耐藥基因在細(xì)菌種內(nèi)和種間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移. 由于生物活性炭表面微生物大量生長(zhǎng)，將進(jìn)一步加速耐藥基因在生物活性炭濾池生物膜上的傳播. 大量可移動(dòng)基因元件的增加對(duì)增強(qiáng)飲用水中微生物的多重耐藥能力發(fā)揮了重要作用. 由圖 4(a)也可發(fā)現(xiàn)，在龍頭水樣品中，轉(zhuǎn)座子水平有明顯升高. 有報(bào)道指出，低濃度的氯消毒劑水平可能會(huì)促進(jìn)可移動(dòng)基因元件在微生物間的水平轉(zhuǎn)移. 而在管網(wǎng)輸配過程中，由于余氯濃度衰減，到用戶末端時(shí)余氯水平常常較低，也為圖 3龍頭水中微生物多重耐藥能力增強(qiáng)提供了理論支持. 無論是細(xì)菌體內(nèi)的耐藥基因還是可移動(dòng)基因元件殘留，攝入人體后均可能與人體腸道菌群相互作用，將抗性片段傳播至人體腸道細(xì)菌，給人體健康帶來危害.具體參見污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1) 在所研究供水系統(tǒng)中共分離鑒定得到 26株菌，分屬 16個(gè)屬，其中 芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、 噬纖維菌屬(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)在整個(gè)供水系統(tǒng)中都有檢出.

　　(2) 在相同抗生素濃度條件下，分離獲得的 芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、 噬纖維菌屬(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌屬(Sphingomonas sp.)的多重耐藥能力強(qiáng)于其它分離菌.在5種抗生素濃度高達(dá)15 μg·mL-1時(shí)，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)對(duì)5種抗生素都有抗性. 除上述3種菌外，其它種類細(xì)菌的耐藥能力隨著抗生素濃度的增加不斷減弱.

　　(3) 經(jīng)過生物活性炭濾池和管網(wǎng)輸配后，3種分離細(xì)菌的多重耐藥能力會(huì)增強(qiáng)，同時(shí)，可移動(dòng)基因元件的絕對(duì)濃度明顯增高. 生物活性炭表面和輸配管網(wǎng)內(nèi)壁高密度的微生物對(duì)耐藥基因在微生物之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，對(duì)飲用水中微生物的多重耐藥性有重要影響.