由于社會經(jīng)濟發(fā)展迅速,各種類型的污染產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng)加劇了我國水環(huán)境生態(tài)的風(fēng)險。在我國城市化程度較高的地區(qū),從飲用水和污水中都檢測出不同類型的新興污染物,如持久性有機物、內(nèi)分泌干擾物、抗生素等。在污水尚未得到有效處理的情況下,水源很容易受到污染,使飲用水的安全供應(yīng)面臨巨大挑戰(zhàn);因此,研究新興污染物對污水處理系統(tǒng)的影響,將為新形勢下污水的有效處理提供指導(dǎo)。

　　四環(huán)素是一類水體中常見的廣譜抗生素 ,它能與核蛋白體的30S 亞單位結(jié)合,阻止氨�；鵷RNA 同核蛋白體結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)的合成。同時,四環(huán)素類藥物的廣泛使用引起了四環(huán)素耐藥細菌在環(huán)境中產(chǎn)生并快速傳播。至今,被發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素耐藥細菌有115 屬、530 種(抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫http:∥ardb. cbcb. umd. edu/ )。不同來源廢水中四環(huán)素的含量差異較大,一般含量在幾十ng·L - 1 到幾百μg·L - 1 之間。近年來,四環(huán)素對污水處理系統(tǒng)的影響引起了廣泛關(guān)注。CETECIOGLU 等 在SBR 中通過測定COD 的含量和氣體的產(chǎn)量的變化發(fā)現(xiàn),當四環(huán)素投加量低于8. 5 mg·L - 1 時,反應(yīng)器內(nèi)底物降解作用不受影響,但產(chǎn)氣量減小了10% ~ 20% ,說明四環(huán)素對系統(tǒng)中微生物造成了影響。AYDIN 等在ASBR中通過測定甲烷產(chǎn)量和揮發(fā)性脂肪酸的積累量的變化發(fā)現(xiàn),不同濃度組合的四環(huán)素、紅霉素和磺胺對同型乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生了不同程度的影響。AYDIN 等 在隨后的研究中又分別運用了real-time PCR 和PCR-DGGE 分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn),四環(huán)素、紅霉素、磺胺3 種抗生素共同影響下產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷古菌存在互營關(guān)系且這種互營關(guān)系對反應(yīng)器的穩(wěn)定運行起關(guān)鍵作用。

　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)已被廣泛使用在研究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落結(jié)構(gòu)中。第2 代Illumina MiSeq 高通量測序能克服傳統(tǒng)檢測方法的缺陷,具有通量高、錯誤率低、成本低、流程自動化、速度快等優(yōu)勢 ,目前已在研究微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)方面受到廣泛認可 ;因此,將Illumina MiSeq 高通量測序方法應(yīng)用于污水處理系統(tǒng)的研究,對深入認識污水處理系統(tǒng)具有實際意義。

　　當前,污水厭氧處理因其高效能、低能耗等特點在污水處理工程上開始受到關(guān)注。它實際上是借助于不同微生物種群間的協(xié)同作用,通過水解—酸化(產(chǎn)氫及產(chǎn)乙酸)—產(chǎn)甲烷等一系列生物反應(yīng)將有機底物轉(zhuǎn)化為甲烷和無機物的過程。在這個過程中,微生物群落構(gòu)成直接影響到污水處理的效果,因此,深入認識污水厭氧消化系統(tǒng)的微生物群落構(gòu)成,對厭氧污水處理系統(tǒng)的穩(wěn)定運行具有指導(dǎo)作用。

　　基于此,本研究通過室內(nèi)模擬實驗,選擇ABR 多相厭氧反應(yīng)器進行連續(xù)流實驗,啟動反應(yīng)器達到穩(wěn)定狀態(tài)后,分別在不含四環(huán)素和含有250 μg·L - 1 四環(huán)素的人工配制污水條件下運行90 d,通過考察來自反應(yīng)器的氫氣、甲烷產(chǎn)生量的變化,運用Illumina MiSeq 高通量測序方法對反應(yīng)器中的微生物群落構(gòu)成進行分析,研究四環(huán)素對污水厭氧處理系統(tǒng)微生物群落造成的影響,以期從微生物關(guān)系角度深入了解這種影響,為污水厭氧處理技術(shù)研究及工程實踐提供參考。

　　1　材料和方法

　　1. 1　實驗裝置

　　ABR 采用厚為5 mm 的有機玻璃板加工制成,尺寸為455 mm × 150 mm × 400 mm,有效容積為21L,置于(35 ± 1)℃ 的恒溫箱中。反應(yīng)器分為3 個格室,按照前后順序分為格室1、格室2、格室3,分別命名為C1、C2、C3,每個格室由上、下流室(體積比為3 ∶ 1) 組成, 折流板底角為45°。格室體積比V1 ∶ V2 ∶ V3 = 1. 5 ∶ 1 ∶ 1。每個格室上部設(shè)有集氣口,側(cè)部分別設(shè)有取水口、取泥口,實驗裝置見圖1。

　　1. 2　接種污泥

　　接種污泥取自廣州市瀝窖污水處理廠A2 / O 工藝的厭氧池。污泥MLSS = 24. 67 g·L - 1 ,MLVSS/MLSS = 0. 61,pH = 6. 58,含水率為97. 30% 。接種污泥體積為反應(yīng)器有效容積的1 /3。

　　1. 3　實驗用水

　　配水以葡萄糖為碳源,NH4 Cl 和KH2 PO4 分別為氮源和磷源,同時加入Ca、Mg、Fe、Co、Ni 等微量元素,以保證微生物細胞合成的需要。此外,向配水中投加一定量的NaHCO3 以保證ABR 內(nèi)的緩沖能力。

　　反應(yīng)器以連續(xù)流方式進水,水力停留時間(HRT)為24 h。在啟動階段,采用逐步增加進水負荷的啟動方式,進水COD 濃度為500 ~ 2 000 mg·L - 1 ,當COD 去除率穩(wěn)定在80% 以上、出水各項指標(pH、堿度、VFA)趨于正常,啟動階段完成。反應(yīng)器的運行先后經(jīng)歷了啟動階段(56 d)、穩(wěn)定運行階段(90 d)、添加四環(huán)素(250 μg·L - 1 )運行階段(90 d)。

　　1. 4　DNA 的提取和PCR 擴增及其微生物多樣性數(shù)據(jù)分析

　　分別在反應(yīng)器的穩(wěn)定運行階段和添加四環(huán)素運行階段每間隔18 d 從每個格室采集一次活性污泥樣本,分別命名為Ctrl D18C1、Ctrl D36C1、Ctrl D54C1、Ctrl D72C1、Ctrl D90C1、Tre D18C1、Tre D36C1、TreD54C1、Tre D72C1、Tre D90C1,其中“Ctrl”代表未添加四環(huán)素運行時的污泥樣本,“Tre”代表添加四環(huán)素運行時的污泥樣本,“D18”代表第18 天取樣,“C1”代表樣本取自格室1,格室2 和格室3 的樣本命名為C2和C3。實驗共從3 個格室中共采集到30 個活性污泥樣本。分別稱取0. 4 g 污泥用于DNA 提取。采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit DNA 提取試劑盒進行DNA 提取,提取步驟依據(jù)說明書操作,提取好的DNA 保存于- 20 ℃ 冰箱。

　　以提取的基因組DNA 作為模板,使用16S rRNA 基因V4 區(qū)特異性引物F515 和R806 進行PCR 擴增,擴增片段長度約為300 bp。本實驗采用50 μL 的PCR 反應(yīng)體系:1 μL 模板,各1 μL 的10 μmol·L - 1正向引物和反向引物(華大),0. 2 μL 20 mg·mL - 1 的蛋白質(zhì)(TaKaRa),25 μL 的Premix Ex Taq Version(Ex Taq Version 2. 0 plus dye)(TaKaRa),21. 8 μL 滅菌水(TaKaRa)。PCR 的反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,31 個循環(huán);72 ℃ 10 min。將各樣品的PCR 產(chǎn)物按照等摩爾量進行混合,使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen,Chatsworth,CA,USA)凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 混合產(chǎn)物,并用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測,最后使用Illumina MiSeq 高通量測序平臺進行基因測序。

　　測序結(jié)束后,首先,使用Trimmomatic (Version 0. 33)軟件去掉序列3′端連續(xù)的低質(zhì)量堿基。接著,用Mothur (Version 1. 35. 1)中的“make. contigs”命令將兩端reads 拼接成完整的目的DNA 片段,再用“screen. seqs”,“trim. seqs” 命令進行錯誤序列的識別和修剪。最后,使用QIIME 軟件對測序數(shù)據(jù)進行微生物的多樣性分析,將得到的序列進行聚類,將97% 相似性的序列聚類成為OTUs (operational taxonomic units)。物種分類由UCLUST (Version 1. 2. 22)軟件 和Greengenes OTU 數(shù)據(jù)庫(gg_13_8_otus) 實現(xiàn)。

　　1. 5　反應(yīng)器氣體產(chǎn)生的分析

　　于固定時間每6 d 測定一次格室內(nèi)產(chǎn)生氣體中氫氣和甲烷的含量,檢測方法為氣相色譜法。使用儀器為安捷倫7820A 氣相色譜儀,檢測器為TCD,色譜柱為TDX-01,色譜條件如下:進樣口、色譜柱、檢測器的溫度分別為100、100 和200 ℃ ;載氣為氮氣,流量為35 mL·min - 1 ;進樣量為1 mL。

　　2　結(jié)果和分析

　　2. 1　四環(huán)素對反應(yīng)器內(nèi)氣體產(chǎn)生的影響

　　ABR 3 個格室中氫氣的產(chǎn)生情況如圖2 所示。僅在格室1 中檢測到氫氣的存在,而格室2 和格室3中沒有檢測到氫氣的產(chǎn)生,這主要是由于格室1 進行的是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸反應(yīng),而后端格室主要進行的是產(chǎn)甲烷反應(yīng)。未添加四環(huán)素運行時,格室1 內(nèi)氫氣的平均產(chǎn)量為0. 010 2 L·(g·d) - 1 (以MLSS 計)。添加四環(huán)素后,氫氣產(chǎn)量是未添加四環(huán)素時氫氣產(chǎn)量平均值的4. 05 ~ 6. 89 倍。說明四環(huán)素的添加能使氫氣產(chǎn)量增加。

　　ABR 3 個格室甲烷產(chǎn)生情況,如圖3 所示。在未添加四環(huán)素時,格室1、格室2、格室3 的甲烷平均產(chǎn)量分別為0. 320 4、0. 146 2、0. 088 1 L·(g·d) - 1(以MLSS 計)。顯然,甲烷產(chǎn)量在縱向上呈降低的趨勢。這與反應(yīng)器內(nèi)的底物分配有關(guān),格室1 進水有機物含量較高,隨著格室內(nèi)微生物的降解作用,有機物含量在縱向上隨著格室逐漸降低,有機物的減少使得甲烷產(chǎn)量在格室間縱向減小。添加四環(huán)素后,格室1、格室2、格室3 的甲烷產(chǎn)量隨著運行時間的推移呈現(xiàn)不同程度的下降,分別是未添加四環(huán)素時對應(yīng)甲烷平均產(chǎn)量的43. 90% ~ 80. 20% 、27. 18%~ 79. 79% 、38. 24% ~ 83. 70% 。通過對比四環(huán)素添加后同一個格室不同時間的甲烷產(chǎn)量變化,發(fā)現(xiàn)甲烷產(chǎn)量隨著運行時間的推移呈現(xiàn)下降趨勢,說明四環(huán)素對產(chǎn)甲烷的抑制作用隨著時間的推移增大。

　　2. 2　微生物豐度分析

　　通過反應(yīng)器中獲取的DNA 序列與GreengenesOTU 數(shù)據(jù)庫進行比對,得出反應(yīng)器中微生物主要有16 個屬,如圖4 所示。分別為甲烷桿菌屬( Methanobacterium)、密螺旋體屬(Treponema)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、長繩菌屬( Longilinea)、叢毛單胞菌屬( Comamonas )、互營桿菌屬( Syntrophobacter)、梭菌屬(Clostridium)、浮霉狀菌屬(Planctomyces)、Blvii28、Paludibacter、AUTHM297、WCHB1-05、A17、W22。

　　由圖4 可知,隨著四環(huán)素的添加,不同物種呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。其中,隨著四環(huán)素的添加,密螺旋體屬(Treponema)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、W22 的豐度在3 個格室內(nèi)均呈現(xiàn)增長的趨勢,說明密螺旋體屬(Treponema)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、W22 對四環(huán)素具有一定耐藥性。

　　密螺旋體屬(Treponema)能利用氫氣和二氧化碳轉(zhuǎn)化成乙酸。添加四環(huán)素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 內(nèi)的密螺旋體屬(Treponema)分別是未添加四環(huán)素時相應(yīng)密螺旋體屬(Treponema)平均豐度的1. 09 ~ 2. 00 倍、1. 27 ~ 1. 79 倍、1. 41 ~ 6. 52 倍,密螺旋體屬(Treponema)豐度的增加說明四環(huán)素的添加能促進氫氣和二氧化碳轉(zhuǎn)化成乙酸的過程,有利于乙酸的積累。有研究表明,乙酸是微生物燃料電池生產(chǎn)電能的首選底物,1 t 生物質(zhì)可產(chǎn)出價值150 美元的乙酸,卻只能產(chǎn)出31 美元的甲烷;因此,在處理四環(huán)素污水時,可以充分利用密螺旋體屬(Treponema)的優(yōu)勢,增加乙酸積累,可以通過耦合系統(tǒng)將乙酸轉(zhuǎn)化為微生物燃料電池能源或作為發(fā)酵工業(yè)的原料,實現(xiàn)資源回收。

　　互營桿菌屬(Syntrophobacter)是一類產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌,能將高級脂肪酸和醇類氧化分解為乙酸和H2 。

　　添加四環(huán)素后,如表1 所示,除了格室1 第18 天和格室3 第54 天的互營桿菌屬(Syntrophobacter)比未添加四環(huán)素時平均豐度低,這可能是由于反應(yīng)器運行過程中其他條件擾動引起的,其他時間內(nèi)格室1、格室2、格室3 內(nèi)的互營桿菌屬(Syntrophobacter)分別是未添加四環(huán)素時相應(yīng)互營桿菌屬(Syntrophobacter)平均豐度的1. 37 ~ 2. 04 倍、1. 00 ~ 3. 95 倍、1. 48 ~ 2. 98 倍,互營桿菌屬(Syntrophobacter)豐度的增加說明四環(huán)素的添加有利于產(chǎn)氫過程,與2. 1 中氫氣產(chǎn)量增大的結(jié)論相印證。氫氣是一種清潔能源,具有燃燒熱值高、燃燒產(chǎn)物無污染的特點,具有很好的應(yīng)用價值;因此,在處理四環(huán)素污水時,可以加強氫氣的回收利用,減小污水處理成本。

　　脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)是一類硫酸鹽還原菌,它能利用金屬表面的有機物作為碳源,將硫酸鹽還原成硫化氫,加速金屬管材的腐蝕。添加四環(huán)素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 內(nèi)的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)分別是未添加四環(huán)素時相應(yīng)脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)平均豐度的1. 09 ~ 3. 99 倍、1. 12 ~3. 59 倍、1. 20 ~ 7. 40 倍,脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度的增加說明四環(huán)素的出現(xiàn)會加劇污水處理系統(tǒng)中金屬管材的腐蝕;因此,在處理四環(huán)素污水時,應(yīng)充分重視處理系統(tǒng)中金屬管材的防腐措施,減少因脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多而造成的損失。

　　格室1 內(nèi)的寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)、格室3 內(nèi)的梭菌屬(Clostridium)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)隨著四環(huán)素的添加,豐度先減小后增加,如表2 所示,在四環(huán)素添加初期,這些微生物物種在相應(yīng)格室內(nèi)受到的抑制作用較大,隨著時間的推移,所受抑制作用減弱,耐藥性增加,說明四環(huán)素的長期污染能使微生物的耐藥性發(fā)生改變。

表1　豐度隨四環(huán)素添加而增大的物種的豐度變化值

表2　豐度隨四環(huán)素添加先減小后增大的物種的豐度變化值

　　2. 3　樣本的主坐標分析( PCoA) 和聚類分析

　　主坐標分析(PCoA)能展示各個樣本間的差異大小,2 個樣本在坐標軸上的距離較近,則表示這2 個樣本的物種組成較相似。圖5 反映了未添加四環(huán)素時和添加四環(huán)素后樣本間物種的差異大小�？梢钥闯�,主成分1 ( PC1) 和主成分2 ( PC2) 是造成樣品的2 個最大差異特征,貢獻率分別為25. 82% 和11. 86% 。未添加四環(huán)素時,C1、C2、C3 的樣本分別聚在一起,C1 和C2 樣本之間距離較近,且和C3 距離較遠,說明未添加四環(huán)素時,C1 和C2 的物種相似性較高,且這2 個格室的物種和C3 格室物種有一定差異。添加四環(huán)素后,C1 和C3 物種在初期有個漸變的過程,后期3 個格室的樣本聚在一起,且與未添加四環(huán)素時有一定距離,說明四環(huán)素添加前后格室內(nèi)物種有較大差異,且隨著四環(huán)素的添加,3 個格室間的物種組成相似性提高。

　　樣品聚類分析圖(圖6) 進一步說明PCoA 的結(jié)果,樣品越靠近,枝長越短,說明2 個樣品的物種組成越相似。由圖6 可以看出,未添加四環(huán)素時,C1 和C2 格室樣品距離較近,枝長較短,說明這2 個格室間物種相似性較高,而C3 格室的樣品在另一個分支上,距離較遠,枝長較長,說明C3 格室的物種與C1、C2 格室的物種具有一定的差異。隨著四環(huán)素的添加,C1 和C3 樣本在初期有個遠離的過程,說明物種有個漸變的過程,在后期3 個格室的樣本距離縮短,相互間枝長變短,說明在后期3 個格室物種相似性增大,且添加四環(huán)素后的3 個格室樣本與未添加四環(huán)素時的樣本分別位于不同的大分支上,說明四環(huán)素的添加使反應(yīng)器內(nèi)微生物產(chǎn)生較大變化。

　　主坐標分析(PCoA) 和樣品聚類分析共同說明了四環(huán)素添加前后反應(yīng)器內(nèi)的微生物的物種組成具有較大差異,四環(huán)素添加后,隨著運行時間的推移,格室間微生物的物種組成相似性增大。產(chǎn)生這種現(xiàn)象主要原因是:由于四環(huán)素耐藥物種的存在,使四環(huán)素添加后不具有四環(huán)素耐藥性的物種逐漸被四環(huán)素耐藥物種取代,隨著運行時間的推移,各格室內(nèi)耐藥物種增多,所以格室間物種相似性增大;由于耐藥物種逐漸取代了不耐藥物種,所以四環(huán)素添加前后反應(yīng)器內(nèi)微生物物種組成有較大差異。說明長期受抗生素污染的污水處理系統(tǒng)對微生物具有選擇性,使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,進一步說明通過污泥馴化能減小抗生素對污水處理系統(tǒng)的不利影響。具體參見污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3　結(jié)論

　　本實驗采用實驗室人工配置污水,對具有3 個格室的ABR 進行連續(xù)流實驗,啟動反應(yīng)器達到穩(wěn)定狀態(tài)后, 分別在無四環(huán)素配置污水和濃度為250μg·L - 1 的四環(huán)配置污水環(huán)境下運行反應(yīng)器90 d,探討2 種條件下氫氣(H2 )、甲烷(CH4 )產(chǎn)量的變化,并運用Illumina MiSeq 高通量測序方法從微觀上揭示上述變化的原因。主要研究結(jié)果如下:1) 四環(huán)素的添加能使氫氣產(chǎn)量增加,四環(huán)素對產(chǎn)甲烷的抑制作用隨著時間的推移增大;2)Illumina MiSeq 測序獲得反應(yīng)器內(nèi)的序列所屬16 個屬,其中,密螺旋體屬(Treponema)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、W22 對四環(huán)素具有一定耐藥性;3)格室1 內(nèi)的寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)、格室3 內(nèi)的梭菌屬(Clostridium)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)對四環(huán)素的耐藥性隨著四環(huán)素污染時間的推移,耐藥性增加,說明四環(huán)素長期的污染能引起微生物的耐藥性發(fā)生改變;在處理四環(huán)素污水時,可以通過以下調(diào)控趨利避害:充分利用密螺旋體屬(Treponema)的優(yōu)勢,增加乙酸積累,可以通過耦合系統(tǒng)將乙酸轉(zhuǎn)化為微生物燃料電池能源或作為發(fā)酵工業(yè)的原料,實現(xiàn)資源回收,在處理四環(huán)素污水時,可以加強氫氣的回收利用,減小污水處理成本;硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多會加劇污水處理系統(tǒng)中金屬管材的腐蝕,因此應(yīng)充分重視處理系統(tǒng)中金屬管材的防腐措施,減少因脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多而造成的損失;4)PCoA 分析和聚類分析結(jié)果表明,四環(huán)素添加前后系統(tǒng)內(nèi)物種組成具有較大差異,四環(huán)素的添加引起了具有四環(huán)素耐藥性物種逐漸取代不具有四環(huán)素耐藥性物種,隨著運行時間的推移,格室間物種相似性增大,說明長期受抗生素污染的污水處理系統(tǒng)對微生物具有選擇性,使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,進一步說明通過污泥馴化能減小抗生素對污水處理系統(tǒng)的不利影響。