1 引言(Introduction)

　　甲烷(CH4)是僅次于CO2的第2種重要的溫室氣體.如何減排溫室氣體CH4成為了全球關(guān)注的焦點(diǎn).同時, 生物脫氮是當(dāng)前廢水處理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).污水處理廠中通常通過硝化和反硝化實(shí)現(xiàn)生物脫氮, 而目前城鎮(zhèn)污水普遍存在C/N比低的問題, 導(dǎo)致在反硝化過程中往往需要大量的外加碳源.而在污水處理廠的厭氧處理過程中會產(chǎn)生大量的甲烷, 如能將這部分甲烷作為碳源進(jìn)行利用, 既減少了甲烷的排放, 又節(jié)省了能源的消耗.反硝化型甲烷厭氧氧化反應(yīng)(Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation, DAMO)正是可以利用甲烷作為碳源完成反硝化脫氮的過程.DAMO過程是以甲烷為電子供體和唯一碳源, 以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體的一種氧化還原反應(yīng).2006年, 該過程在實(shí)驗(yàn)室中得以證實(shí)(Raghoebarsing et al., 2006).在自然界中, 溶解于水中的甲烷主要靠甲烷氧化菌等通過生物作用得以消耗;現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在淡水系統(tǒng)、濕地系統(tǒng)、近海海洋生態(tài)系統(tǒng)中(Deutzmann et al., 2011;Luesken et al., 2011;Kojima et al., 2012;Wang et al., 2012;Han et al., 2013;Shen et al., 2013;Shen et al., 2014)均有存在可以耦合甲烷厭氧氧化作用(Anaerobic Oxidation of Methane, AOM)和反硝化作用(Denitrification)的DAMO(Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation, 反硝化型甲烷厭氧氧化)微生物.根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析, 研究者檢測到的DAMO細(xì)菌隸屬于NC10門細(xì)菌;DAMO古菌則屬于甲烷厭氧氧化古菌ANME-2(Raghoebarsing et al., 2006).2017年, Wang等(2017)提出了側(cè)流式、主流式兩種DAMO反應(yīng)應(yīng)用于污水處理廠的設(shè)想.

　　目前污水處理廠進(jìn)水多為低碳高氮性質(zhì), 多種化工、制藥廢水及垃圾滲濾液等, 都含有較高濃度的氨氮, 而高濃度的氨氮會對活性污泥中的微生物起抑制作用(鄭雄柳等, 2014), 并會影響系統(tǒng)微生物菌群結(jié)構(gòu).目前已有研究報道高濃度氨氮對活性污泥系統(tǒng)中硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌等微生物具有抑制作用(Zhou et al., 2011), 但對DAMO微生物的影響及機(jī)理鮮見報道.如欲將DAMO工藝應(yīng)用于廢水生物脫氮, 探明氨氮對該過程的影響顯得尤為重要.因此, 本文利用已經(jīng)成功富集的以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢菌種的系統(tǒng)(以下簡稱DAMO細(xì)菌系統(tǒng))(樓菊青等, 2016)為研究對象, 通過短期和長期試驗(yàn), 從宏觀和微觀兩個層面, 研究氨氮對DAMO過程脫氮性能、微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響, 綜合考察DAMO細(xì)菌對氨氮的應(yīng)激性、耐受性, 并探索其抑制機(jī)理.為促進(jìn)對DAMO微生物脫氮機(jī)理的研究和完善DAMO理論的發(fā)展添磚加瓦, 為該工藝向?qū)嶋H工程應(yīng)用推進(jìn)一步.

　　2 試驗(yàn)材料與方法(Materials and methods)2.1 材料2.1.1 試驗(yàn)系統(tǒng)

　　本文的試驗(yàn)系統(tǒng)是基于之前已成功富集的以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢菌種的混培物(樓菊青等, 2016).所得混培物是以淡水河道(西溪河)底泥、淡水湖泊(西湖)底泥及水稻農(nóng)田土壤的混合物為接種污泥, 甲烷和亞硝酸鹽為唯一碳氮源.至本試驗(yàn)止, 系統(tǒng)已穩(wěn)定運(yùn)行1392 d.

　　2.1.2 試驗(yàn)裝置

　　試驗(yàn)裝置為特制的直徑為7.5 cm、高度為17 cm的500 mL厭氧反應(yīng)器.

　　2.2 試驗(yàn)方法2.2.1 短期試驗(yàn)方法

　　① 不同濃度氨氮對DAMO細(xì)菌的影響：通過批式實(shí)驗(yàn)研究氨氮對以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢菌種系統(tǒng)(以下簡稱DAMO細(xì)菌系統(tǒng))的短期影響, 設(shè)3個平行試驗(yàn)組和一個對照組, 試驗(yàn)時長7 d, 氨氮濃度梯度分別為50、250、500、750、1000、1250、1500 mg·L-1.每12 h取3 mL水樣, 利用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行三氮(氨氮NH4+-N、硝態(tài)氮NO3--N、亞硝態(tài)氮NO2--N)的測定.在最高氨氮梯度濃度試驗(yàn)后, 取泥水混合液10 mL進(jìn)行掃描電鏡分析實(shí)驗(yàn).②不同pH體系下氨氮的影響：根據(jù)上述短期試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行批式試驗(yàn), 選取750 mg·L-1氨氮作為試驗(yàn)濃度.用0.1 mol·L-1 HCl或0.1 mol·L-1 NaOH分別將pH調(diào)節(jié)為6.5、6.8、7.0、7.5、7.8 5個濃度并利用pH計(jì)實(shí)時監(jiān)控反應(yīng)器內(nèi)的pH值, 使其保持在相應(yīng)的范圍內(nèi), 每組試驗(yàn)持續(xù)7 d.取樣與測定同①.當(dāng)T = 27 ℃時, 不同pH體系對應(yīng)的FA濃度可由公式(1)計(jì)算得到.

　　式中, cFA為FA的濃度(mg·L-1);cNH4+為氨氮的濃度(mg·L-1);T為溫度(℃)

　　2.2.3 長期試驗(yàn)方法

　　氨氮對DAMO細(xì)菌的長期影響試驗(yàn)以短期試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù), 將長期試驗(yàn)分為連續(xù)的4個階段, 每個階段7 d, 這4個階段的氨氮濃度按照短期試驗(yàn)濃度依次遞增(李媛, 2014), 濃度分別為500、750、1000、1250 mg·L-1, 在28 d后取樣進(jìn)行高分子通量測序.

　　2.3 分析方法2.3.1 常規(guī)指標(biāo)測定

　　NO3--N、NO2--N、NH4+-N測定方法參考《水和廢水監(jiān)測分析方法》第四版(魏復(fù)盛, 2002).

　　2.3.2 微生物微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

　　利用掃描電鏡對微生物微觀形態(tài)進(jìn)行特性分析.在每個階段的短期試驗(yàn)過程中, 取10 mL樣品, 在4000 r·min-1條件下離心5 min, 取上清液, 樣品處理后用掃描電子顯微鏡SEM(SU8010, Hitachi)進(jìn)行微生物微觀形態(tài)的特性分析.

　　2.3.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

　　提取長期試驗(yàn)前后污泥樣品中的基因組DNA, 儲于-20 ℃以下, 并利用高通量測序分析.利用上海申能博彩生物科技有限公司生產(chǎn)的3S柱離心式DNA抽提試劑盒進(jìn)行樣品DNA的提取;利用特定PCR引物進(jìn)行序列擴(kuò)增, 全部樣本按照正式試驗(yàn)條件均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn);參照電泳初步定量結(jié)果, 將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量, 之后按照每個樣本的測序量要求, 進(jìn)行相應(yīng)比例的混合;通過構(gòu)建Miseq文庫、Miseq測速對16S RNA序列進(jìn)行測序;區(qū)分樣本后, 采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析, 與Silva數(shù)據(jù)庫比對, 并在門、綱、屬3個水平統(tǒng)計(jì)每個樣品的群落組成.

　　3 結(jié)果與討論(Results and discussion)3.1 氨氮對DAMO細(xì)菌的短期影響3.1.1 氨氮對以DAMO細(xì)菌脫氮性能的影響

　　不同濃度梯度(50~950 mg·L-1)的氨氮對DAMO細(xì)菌的脫氮性能影響見圖 1.其中圖 1a表示不同濃度氨氮作用下, 系統(tǒng)內(nèi)亞硝酸氮的消耗曲線, 圖 1b表示不同濃度下亞硝酸氮的消耗速率與對照組的比值, 以v表示試驗(yàn)組亞硝酸氮的消耗速率, v0表示對照組亞硝酸氮的消耗速率.其中誤差范圍由標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.

　　圖 1

　　圖 1不同濃度NH4+-N對DAMO細(xì)菌脫氮性能的影響 (a.NO2--N消耗曲線, 以N計(jì);b.試驗(yàn)組與對照組的比值)

　　當(dāng)控制pH實(shí)驗(yàn)條件為7.0時, 通過公式(1)計(jì)算可知FA = 4.879 mg ·L-1, 由圖 1可見, 在一定范圍內(nèi), DAMO細(xì)菌脫氮性能隨著氨氮濃度的增加而降低.由圖 1a可知, 在空白對照組中, 其亞硝酸鹽初始濃度為30.19 mg·L-1, 7 d平均消耗速率為2.92 mg·L-1·d-1.在50、250 mg ·L-1氨氮作用下, 系統(tǒng)的亞硝酸氮的消耗速率分別為2.94 mg ·L-1·d-1和2.96 mg·L-1·d-1.相比于對照組, 消耗速率略有上升, 但經(jīng)過單因素方差分析后可知, 其p值為0.65, 大于0.05, 說明3組數(shù)據(jù)無顯著性差異, 從而表明在50、250 mg·L-1氨氮作用下, 系統(tǒng)的脫氮性能并未出現(xiàn)抑制或促進(jìn)現(xiàn)象(故該兩組數(shù)據(jù)未在圖 1a中表示).而當(dāng)氨氮濃度增加至500 mg·L-1時, 7 d平均亞硝酸鹽消耗速率下降為2.42 mg·L-1·d-1, 其消耗速率為對照組的82.71%.當(dāng)氨氮濃度為750 mg·L-1時, 7 d平均消耗速率與對照組相比, 下降了43.15%.當(dāng)在1000 mg·L-1氨氮抑制條件下, 經(jīng)7 d的消耗后, 消耗速率下降了56.20%.在1250 mg·L-1氨氮抑制條件下, 亞硝酸鹽7 d平均消耗速率僅為對照組的27.27%.Dapena-Mora等的研究認(rèn)為針對厭氧氨氧化細(xì)菌, 氨氮的IC50為770 mg·L-1, 與本試驗(yàn)結(jié)果相近(Dapena-Mora A, 2007), 可見, DAMO細(xì)菌對高氨氮廢水表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗沖擊負(fù)荷的能力.這有利于DAMO細(xì)菌系統(tǒng)在含高氨氮廢水處理廠中的應(yīng)用.

　　3.1.2 不同pH條件下氨氮對以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢菌種系統(tǒng)的影響

　　根據(jù)3.1.1節(jié)的短期試驗(yàn)結(jié)果, 選取750 mg·L-1的氨氮濃度進(jìn)行試驗(yàn).當(dāng)T=27 ℃, 不同pH體系下, 對應(yīng)的FA的濃度可由公式(1)計(jì)算得到, 計(jì)算結(jié)果見表 1.

　　圖 2為不同pH時, DAMO細(xì)菌系統(tǒng)受氨氮影響時的脫氮性能.以pH = 7.0為對照組, 各pH條件下脫氮速率與該條件下脫氮速率比值為縱坐標(biāo), 得圖 2b, 由圖 2可知, 在堿性條件下(pH = 7.0、7.5、8.0), 同樣為750 mg·L-1的氨氮, 隨著pH升高, FA升高, 脫氮速率下降, 當(dāng)pH=8.0時, 其FA濃度為46.09 mg·L-1, 此時脫氮速率不到對照組的1/2, 且對pH=7.0、7.5、8.0條件下所得3組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析, 其p值為9.93×10-5, 遠(yuǎn)小于0.01, 說明這3組數(shù)據(jù)之間有極顯著差異;而在酸性條件下(pH = 6.5、6.8、7.0), 雖然FA值隨著pH值的升高而升高, 但通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)脫氮速率與FA值并無顯著性差異.這說明在堿性條件下, 氨氮對系統(tǒng)的抑制效果與FA值有關(guān), FA是限制性抑制因子, 該結(jié)果與氨氮對其他微生物抑制的大多數(shù)研究結(jié)果相吻合(Anthonisen, 1976);在酸性條件下, 抑制效果與FA的濃度無關(guān), 認(rèn)為離子化氨氮應(yīng)是真正的抑制因子.該結(jié)果與之前部分研究相吻合, 當(dāng)溶液呈酸性(pH < 7.0)時, 厭氧氨氧化菌、甲烷菌、反硝化菌等微生物活性受到抑制;甲烷菌(Lay, 1997)等的活性取決于離子化氨氮NH4+的濃度, 而不是質(zhì)子化氨氮FA的濃度.

　　圖 2

　　圖 2不同pH下NH4+-N對DAMO細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)NO2-消耗情況及脫氮性能的影響 (a.不同pH條件下NO2--N消耗曲線;b.不同pH條件下NH4+-N對系統(tǒng)脫氮性能的影響)

　　3.1.3 氨氮對DAMO細(xì)菌系統(tǒng)的微觀形態(tài)影響

　　在1500 mg·L-1的氨氮抑制試驗(yàn)7 d后, 取污泥混合液10 mL離心后, 利用掃描電鏡分別觀察抑制前后的污泥結(jié)構(gòu)與微生物微觀形態(tài)特性, 結(jié)果見圖 3.由圖 3可知, 氨氮抑制試驗(yàn)之前, 在SEM下的絮狀污泥微觀結(jié)構(gòu)清晰可見, 細(xì)菌形狀多樣, 以菌膠團(tuán)的形式聚合在一起, 其中占主導(dǎo)地位的是球狀菌和短桿狀菌, 絲狀菌數(shù)量較少.菌的表面較為光滑, 附著有少量胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS).具體聯(lián)系污水寶或參見http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 3

　　圖 3氨氮抑制前后DAMO細(xì)菌系統(tǒng)掃描電鏡照片 (a.氨氮抑制前, b.氨氮抑制后)

　　經(jīng)高濃度氨氮短期抑制后的污泥與抑制之前相比, 結(jié)構(gòu)變得松散, 絲狀菌大量繁殖, 球狀菌和短桿狀菌則大量減少, 污泥出現(xiàn)了明顯的膨脹現(xiàn)象.而污泥中的微生物出現(xiàn)了明顯的皺縮現(xiàn)象, 另外微生物表面還包裹著一層粘性物質(zhì).由于聚合物覆蓋在微生物的表面, 在環(huán)境與微生物胞膜之間形成一個緩沖層, 這種緩沖層有助于保護(hù)細(xì)胞體免受有毒物質(zhì)損害, 從生物反饋機(jī)制上理解：在環(huán)境條件改變的情況下, 微生物分泌大量EPS的行為可以歸結(jié)為生物應(yīng)激性的一種表現(xiàn), 從而能夠最大程度地避免微生物細(xì)胞體受危害.所以, 微生物表面包裹著的這層粘性物質(zhì)應(yīng)為細(xì)菌所分泌的EPS(鄭雄柳, 2014), 用以抵抗外界的不利因素.

　　3.2 氨氮對DAMO細(xì)菌的長期影響3.2.1 氨氮對以DAMO細(xì)菌脫氮性能的影響

　　氨氮對DAMO細(xì)菌系統(tǒng)長期抑制后對系統(tǒng)脫氮性能影響結(jié)果見圖 4.

　　圖 4

　　圖 4 DAMO細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)NO2--N消耗曲線及長期抑制對脫氮性能的影響 (a.系統(tǒng)NO2--N消耗曲線;b.長期抑制對系統(tǒng)脫氮性能的影響)Fig. 4 NO2--N consumption and nitrogen removal performance in DAMO bacteria System under long term inhibition (a. NO2--N consumption curve; b. nitrogen removal performance in DAMO bacteria System)

　　控制第一階段(1~7 d)氨氮濃度維持在500 mg·L-1左右, 亞硝酸鹽初始實(shí)測濃度為29.95 mg·L-1, 7 d內(nèi)平均消耗速率為2.37 mg·L-1·d-1, 與空白對照組相比其消耗速率下降了20.80%(圖 4b), 出現(xiàn)明顯抑制效應(yīng), 此時抑制效果與短期試驗(yàn)基本沒有差別.控制第二階段(8~14 d)氨氮的濃度為750 mg·L-1左右, 亞硝酸鹽初始實(shí)測濃度為30.95 mg·L-1, 7 d平均消耗速率為1.14 mg·L-1·d-1, 與對照組相比其消耗速率下降62.02%, 而同樣為750 mg·L-1的短期試驗(yàn)中, 其消耗速率只下降了43.15%.第三階段(15~21 d)氨氮的濃度控制在1000 mg·L-1左右, 該階段亞硝酸鹽初始濃度為31.91 mg·L-1, 7 d平均消耗速率為0.54 mg·L-1·d-1, 其消耗速率僅僅達(dá)到了對照組的18.04%(圖 4b), 而短期試驗(yàn)該濃度下的NO2--N消耗速率卻還有對照組的43.80%, 可見, 與短期抑制相比, 在長期抑制條件下, 氨氮的毒性具有累積效應(yīng).

　　當(dāng)氨氮的濃度上升到1250 mg·L-1時(22~28 d), 7 d內(nèi)其亞硝酸氮的消耗速率僅為對照組的6.69%, 且經(jīng)過單因素方差分析后發(fā)現(xiàn), 與氨氮濃度為1000 mg·L-1條件下所得數(shù)據(jù)并無顯著性差異, 從而表明當(dāng)控制氨氮濃度為1000 mg·L-1時, DAMO細(xì)菌系統(tǒng)的脫氮性能已基本被抑制.在長期抑制試驗(yàn)的pH條件下(7.0), 氨氮濃度為500、750、1000 mg·L-1時, 其相對應(yīng)的FA分別為3.253、4.879、6.505 mg·L-1, 其FA濃度依次升高, 而根據(jù)3.1.2節(jié)試驗(yàn)結(jié)果可知, 在pH = 7.0~7.5條件下, 氨氮對系統(tǒng)的抑制效果與FA值相關(guān), FA增加, 抑制效果增強(qiáng).

　　3.2.2 氨氮對DAMO系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu)的影響

　　本試驗(yàn)利用第二代高通量測序技術(shù)Miseq高通量測序揭示氨氮抑制前后微生物群落多樣性的變化, 結(jié)果詳見表 2.其中, Coverage表示樣本文庫的覆蓋率, 其數(shù)值越高, 則樣本中序列被測出的概率就越高, 該指數(shù)反應(yīng)測序結(jié)果是否代表了微生物的真實(shí)情況.在本試驗(yàn)中, 所有Coverage指數(shù)均為99.85%, 故此次測序結(jié)果真實(shí)可靠.由表 2可知, 在經(jīng)過4周高濃度氨氮抑制之后, OTUs的數(shù)值出現(xiàn)了明顯的下降, DAMO細(xì)菌系統(tǒng)初始的OTUs為288.00, 但抑制后僅為227.00, 此外, 表征群落豐度的指標(biāo)Chao1值和Ace值也分別從320.00、328.98下降到255.27和255.64, 說明在抑制過程中系統(tǒng)內(nèi)物種數(shù)不斷減少.而表征群落多樣性的指標(biāo), Shannon指數(shù)從3.11下降到2.26;Simpson指數(shù)從0.09上升到0.11, 說明抑制過程中系統(tǒng)內(nèi)群落多樣性在不斷減少.綜上可知, 氨氮對以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢菌種的微生物系統(tǒng)有明顯的抑制作用, 長期抑制后, 微生物系統(tǒng)的物種豐度以及多樣性明顯下降.

　　基于第二代高通量測序技術(shù)Miseq高通量測序, 對16S RNA序列進(jìn)行測序.氨氮抑制前后DAMO細(xì)菌系統(tǒng)的微觀群落結(jié)構(gòu)組成見圖 5.

　　圖 5

　　圖 5氨氮抑制前后DAMO細(xì)菌系統(tǒng)微觀群落結(jié)構(gòu) (a.氨氮抑制前;b.氨氮抑制后)

　　從圖 5可見, 氨氮對系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)有較大影響.

　　從門的層次上, 氨氮抑制實(shí)驗(yàn)前后均檢測到28類已知門類的細(xì)菌, 其中氨氮抑制實(shí)驗(yàn)前占優(yōu)勢地位的是變形菌門(Proteobacteria, 35.13%)、綠菌門(Chlorobi, 30.25%)、浮霉菌門(Planctomycetes, 14.03%)和綠彎菌門(Chloroflexi, 12.54%).這幾類細(xì)菌都是厭氧脫氮生物反應(yīng)器中常見的細(xì)菌(Guo, 2015; Shu, 2015).而在氨氮抑制實(shí)驗(yàn)以后, 占據(jù)優(yōu)勢地位的門類細(xì)菌種類不變, 但其比例已較抑制前發(fā)生較大改變, 變形菌門(Proteobacteria)從35.13%上升到67.23%, 綠菌門(Chlorobi)的比例從抑制前的30.25%下降到抑制后的16.94%, 而綠彎菌門(Chloroflexi)從12.54%下降到3.84%, 浮霉菌門(Planctomycetes)的比例從14.03%下降到1.08%.變形菌門在高濃度氨氮氮條件下比例升高, 說明高濃度氨氮對其有一定的促進(jìn)作用;而對于綠菌門門、綠彎菌門及浮霉菌門, 抑制作用則十分顯著.

　　在綱的層次上進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 氨氮抑制實(shí)驗(yàn)前, 變形菌門中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Gammaproteobacteria均被檢測到, 其比例分比為：8.75%, 8.46%, 3.09%, 14.63%.但占比最大的是隸屬于綠菌門的Ignavibacteria(28.72%).系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群為屬于綠菌門的Melioribacter, 屬于變形菌門的Methylomonas(甲基單胞菌屬), 及屬于浮霉菌門的SM1A02, 其比例分別為19.66%, 13.84%和13.07%.其次是屬于浮霉菌門的Phycisphaerae占比13.97%, 以及屬于綠彎菌門的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)占6.68%.綠彎菌門所屬細(xì)菌多為厭氧細(xì)菌.Melioribacter所屬的Ignavibacteria是綠菌門中唯一一類化能自養(yǎng)菌, 兼性厭氧(Podosokorskaya, 2013), 它與浮霉菌門的SM1A02都曾在厭氧氨氧化或其他具有反硝化功能的微生物系統(tǒng)中被檢測到(Chu, 2015).而在氨氮抑制實(shí)驗(yàn)以后, 深入分析發(fā)現(xiàn), 隸屬于綠菌門的Ignavibacteria其比例由抑制前的28.72%下降到10.44%, 這也是綠菌門比例下降的主要原因, 另外屬于綠菌門(Chlorobi)的綠硫細(xì)菌(Chlorobia)的比例從1.53%上升到6.51%.屬于綠彎菌門的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)也在氨氮的作用下由之前的6.68%下降到3.09%.屬于浮霉菌門的Phycisphaerae抑制前占比13.97%, 抑制后下降到0.99%.由此表明, 氨氮對Ignavibacteria、Anaerolineae以及Phycisphaerae有明顯的抑制作用.而在變形菌門中, 除Betaproteobacteria的比例從8.46%下降到6.58%外, Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria其比例分別從8.75%, 3.09%, 14.63%上升至18.71%, 5.20%, 35.70%, 這直接導(dǎo)致了在門的水平上, 變形菌門比例的顯著上升, 說明氨氮對變形菌門的促進(jìn)作用主要集中在Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria以及Gammaproteobacteria.

　　通過對屬水平上群落結(jié)構(gòu)的分析可發(fā)現(xiàn), 優(yōu)勢菌種在高濃度氨氮作用下發(fā)生了改變, 原本的優(yōu)勢菌是屬于綠菌門的Melioribacter, 但其比例從抑制前的19.66%下降到7.58%, 說明該類菌對高氨氮的耐受性較差;屬于變形菌門的Methylomonas(甲基單胞菌屬), 其比例從13.84%下降到0.01%, 這種甲烷氧化細(xì)菌比例的下降, 應(yīng)是系統(tǒng)脫氮性能下降的原因之一, Methylomonas(甲基單胞菌屬)在甲烷濃度較低的環(huán)境中具有一定的競爭力(Zeng, 2016), Kim等在該菌屬的細(xì)菌中檢測到了編碼甲烷單加氧酶(MMO)的基因而甲烷單加氧酶是甲烷氧化過程的第一步也是關(guān)鍵一步的催化劑(Kim, 2016), 同時在荷蘭的Lieshout污水處理廠底泥的DAMO分子檢測結(jié)果可知在系統(tǒng)發(fā)育樹中(Luesken, 2011)、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)富集成功的DAMO微生物的Illumina序列分析結(jié)果中(Siniscalchi, 2017)等均有發(fā)現(xiàn)該菌屬的存在;屬于浮霉菌門的SM1A02, 其比例從13.07%下降到0.26%;同時出現(xiàn)了新的優(yōu)勢菌種, 與Methylomonas(甲基單胞菌屬)同屬于變形菌門Gammaproteobacteria的Arenimonas其比例由0.01%上升到29.17%, 說明該類細(xì)菌在受長期高濃度氨氮影響的DAMO細(xì)菌系統(tǒng)中具有一定優(yōu)勢, 亦對高濃度氨氮有較強(qiáng)的耐受能力.該類細(xì)菌多為桿狀菌, 革蘭氏陰性菌, 無芽孢, 無鞭毛, 不可移動, 但對于其在脫氮微生物系統(tǒng)中的作用尚不明朗.另外由于自然界中含有大量的不可培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物, 導(dǎo)致眾多菌群的生物學(xué)分類是未知的, 因而在序列信息比對過程中, 數(shù)據(jù)庫中鑒定到屬水平的菌種只是自然界的一部分, 大量的有效序列目前還無法找到合適的配對信息, 同時表明, 系統(tǒng)中囊括了未知菌屬, 需要進(jìn)一步深入探究.

　　綜上可知, 在氨氮長期抑制作用下, DAMO細(xì)菌系統(tǒng)中物種豐度, 多樣性以及群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變, 而Methylomonas(甲基單胞菌屬)的減少應(yīng)是系統(tǒng)脫氮性能下降的主要原因.

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1) 高濃度氨氮會影響DAMO微生物的生長和性能.在短期抑制條件下, 氨氮對DAMO細(xì)菌的安全濃度為250 mg·L-1;當(dāng)氨氮濃度增至500 mg·L-1時, DAMO細(xì)菌的脫氮效率受到明顯抑制, 隨著濃度、時間的增加, 氨氮對其的抑制效果增強(qiáng);當(dāng)氨氮濃度增加到1500 mg·L-1時, 系統(tǒng)基本喪失脫氮性能.

　　2) 抑制前后的污泥結(jié)構(gòu)與微生物微觀形態(tài)特性經(jīng)過掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn), 高濃度氨氮短期抑制后, 污泥結(jié)構(gòu)均變得松散, 絲狀菌大量繁殖, 球狀菌和短桿狀菌則大量減少, 污泥出現(xiàn)明顯的膨脹現(xiàn)象, 同時微生物分泌大量EPS, 以抵抗外界的不利環(huán)境.

　　3) 在不同pH體系下, 起到真正抑制作用的抑制因子不同, 在堿性條件下, FA為主要抑制因子;在酸性條件下, 離子化的氨氮為主要的抑制因子.

　　4) 在相同氨氮抑制濃度下, 與短期試驗(yàn)相比較, 長期抑制條件下DAMO細(xì)菌脫氮速率更低.氨氮濃度增加到1250 mg·L-1時, 脫氮性能就被完全抑制.

　　5) 高通量測序技術(shù)分析結(jié)果顯示, 經(jīng)長期的氨氮抑制后, DAMO系統(tǒng)內(nèi)的物種多樣性和豐度都大大降低, 菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變, 變形菌門比例明顯上升, 綠菌門、綠彎菌門及浮霉菌門比例下降.尤其是Methylomonas(甲基單胞菌屬)數(shù)量的減少, 導(dǎo)致了系統(tǒng)脫氮效率降低.(來源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報 作者：樓菊青)