目前，厭氧氨氧化（ANAMMOX）工藝被廣泛應(yīng)用。在有機(jī)物存在的環(huán)境中，ANAMMOX和反硝化可以協(xié)同作用，從而減弱有機(jī)物對(duì)ANAMMOX的影響，提高脫氮性能。在耦合系統(tǒng)中，當(dāng)有機(jī)物濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)使反硝化活性增強(qiáng)，ANAMMOX失去反應(yīng)的主導(dǎo)作用，從而破壞耦合系統(tǒng)的平衡，使整體脫氮性能下降。有研究表明，適當(dāng)提高亞硝態(tài)氮濃度，可有效緩解這種抑制作用。

亞硝態(tài)氮作為ANAMMOX和反硝化反應(yīng)的共同基質(zhì)，不足時(shí)會(huì)對(duì)脫氮性能產(chǎn)生影響，不利于很好地反映厭氧氨氧化反應(yīng)器對(duì)有機(jī)物的極限承受能力。研究表明，保證亞硝態(tài)氮充足，以葡萄糖為有機(jī)物，當(dāng)進(jìn)水葡萄糖濃度（以COD計(jì)）為100mg/L時(shí)，顆粒污泥具有良好的厭氧氨氧化耦合反硝化脫氮活性，而當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到200mg/L時(shí)，顆粒污泥的厭氧氨氧化耦合反硝化脫氮活性較差。由于不同種類不同濃度的有機(jī)物對(duì)厭氧氨氧化菌和反硝化菌的影響不同，因此有必要研究其他有機(jī)物在亞硝態(tài)氮充足的條件下對(duì)厭氧氨氧化耦合反硝化系統(tǒng)的影響。乙酸鈉為常見(jiàn)的有機(jī)物，相比葡萄糖，其代謝途徑較簡(jiǎn)單、反硝化速率較快。為此，筆者利用連續(xù)流反應(yīng)器，在底物亞硝態(tài)氮充足的條件下，考察不同濃度乙酸鈉對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器脫氮性能的影響，并通過(guò)皮爾遜相關(guān)性分析探討反應(yīng)器中不同底物變化量的相關(guān)性，同時(shí)，采用高通量測(cè)序方法考察添加乙酸鈉前后顆粒污泥的菌群變化情況，進(jìn)一步明確不同有機(jī)物對(duì)耦合脫氮顆粒污泥反應(yīng)器的抑制特性，以期為相關(guān)研究和應(yīng)用提供借鑒。

1、材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)為連續(xù)流實(shí)驗(yàn)，采用有效容積為10L的UASB厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器，如圖1所示，外部包裹黑色軟性材料以避光。

進(jìn)水由蠕動(dòng)泵打入反應(yīng)器底部，通過(guò)水浴控制反應(yīng)器內(nèi)溫度為25℃，水力停留時(shí)間（HRT）控制在0.96h，顆粒污泥上方填充直徑為2.5cm的鮑爾環(huán)載體以減少污泥流失。

1.2 接種污泥和進(jìn)水水質(zhì)

反應(yīng)器接種4L厭氧氨氧化顆粒污泥，其揮發(fā)性懸浮固體濃度為4500mg/L，平均粒徑為2mm。

反應(yīng)器進(jìn)水采用人工配水，主要成分為NH4Cl、NaNO2、NaHCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、有機(jī)物（乙酸鈉）和微量元素。NaHCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2濃度分別為1.25、0.01、0.3和0.0056g/L。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)階段，各個(gè)階段的進(jìn)水NH4Cl、NaNO2、乙酸鈉（以COD計(jì)）濃度見(jiàn)表1。為了保證底物亞硝態(tài)氮充足，在不同階段相應(yīng)地提高進(jìn)水亞硝態(tài)氮濃度。

1.3 分析項(xiàng)目和方法

NH4+-N：納氏試劑分光光度法；NO2--N：N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法；NO3--N：麝香草酚分光光度法；MLSS、MLVSS：重量法；溫度：WTW/Multi3420測(cè)定儀。取NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度之和為TN濃度。

采用細(xì)菌16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析顆粒污泥的菌群結(jié)構(gòu)及變化。在不同運(yùn)行階段從反應(yīng)器中取顆粒污泥樣品（取穩(wěn)定運(yùn)行期即階段A的顆粒污泥樣品R1和以乙酸鈉為有機(jī)物時(shí)運(yùn)行末期即階段D的顆粒污泥樣品R3），送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序分析。將高通量測(cè)序結(jié)果得到的有效序列進(jìn)行聚類分析，采用Usearch軟件把相似度為97%的序列歸為同一個(gè)OTU。將得到的全部OTU與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在門(mén)和屬進(jìn)行不同分類學(xué)水平的菌群結(jié)構(gòu)分析。

1.4 計(jì)算方法

對(duì)反應(yīng)器中的厭氧氨氧化耦合反硝化脫氮性能進(jìn)行分析，具體計(jì)算公式如下（下角標(biāo)AN和DN分別表示厭氧氨氧化和反硝化）

厭氧氨氧化對(duì)NO2--N的去除比例（η1）和反硝化對(duì)NO2--N的去除比例（η2）的計(jì)算方法如下：

本實(shí)驗(yàn)以氮素的降解速率評(píng)價(jià)耦合系統(tǒng)的污泥活性及脫氮性能。

2、結(jié)果與討論

2.1 亞硝態(tài)氮足量時(shí)反應(yīng)器的脫氮性能

底物亞硝態(tài)氮足量時(shí)，乙酸鈉濃度對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響如圖2和圖3所示。階段A進(jìn)水中未添加乙酸鈉有機(jī)物，反應(yīng)器具有良好的厭氧氨氧化脫氮性能，出水NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度平均值分別為1.6、7.3和18.1mg/L，NH4+-N、NO2--N和TN的平均去除率分別為96.5%、89.5%和77.5%。階段B、C、D進(jìn)水中分別添加了20、35和50mg/L的乙酸鈉有機(jī)物，為了保證反應(yīng)器內(nèi)的底物亞硝態(tài)氮足量，進(jìn)水NO2--N濃度均提高至77mg/L左右，出水NO2--N濃度為8.8~56.7mg/L，出水TN濃度逐漸升高，到階段D末期（第120天），TN濃度升至104.4mg/L，TN去除率降為18.7%，耦合系統(tǒng)的脫氮性能受到嚴(yán)重影響。

由圖3可知，氨氮去除率在階段B的前12d（即第31~42天）保持穩(wěn)定并維持在較高水平（約為98.14%），較階段A有所提升。但從第43天開(kāi)始，氨氮去除率開(kāi)始降低，到階段D末期，氨氮去除率降到8.74%（第120天）。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，通過(guò)厭氧氨氧化去除的亞硝態(tài)氮比例顯著降低。經(jīng)過(guò)計(jì)算，在階段B，厭氧氨氧化過(guò)程消耗的NO2--N比例平均為89.47%，此時(shí)ANAMMOX占耦合反應(yīng)的主要地位，耦合效果良好；階段C結(jié)束時(shí)（第90天）為86%左右；在階段D，厭氧氨氧化消耗的NO2--N比例持續(xù)降低，第120天降到34.32%，ANAMMOX失去耦合反應(yīng)的主導(dǎo)地位，體系中主要為反硝化作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，以乙酸鈉為有機(jī)物，保證系統(tǒng)內(nèi)NO2--N充足，提高乙酸鈉濃度，短期內(nèi)對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌沒(méi)有影響（階段B前12d），但繼續(xù)馴化則導(dǎo)致氨氮去除率降低。當(dāng)乙酸鈉濃度為20mg/L時(shí)，系統(tǒng)的脫氮性能良好，但ANAMMOX活性受到部分影響；當(dāng)乙酸鈉濃度增至50mg/L時(shí)，ANAMMOX受到嚴(yán)重抑制，耦合系統(tǒng)的脫氮性能變差。而在以往的研究中，以葡萄糖為有機(jī)物、當(dāng)COD濃度為50mg/L時(shí)，系統(tǒng)的脫氮性能良好且ANAMMOX活性并未受到影響；當(dāng)COD濃度升高到200mg/L時(shí)，系統(tǒng)脫氮性能開(kāi)始明顯降低，ANAMMOX活性出現(xiàn)明顯抑制。分析原因，這主要與葡萄糖和乙酸鈉的代謝不同有關(guān)，相比葡萄糖，乙酸鈉為小分子有機(jī)物，代謝較為簡(jiǎn)單，對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌影響較大。Zheng等的研究表明，在相同C/N下，分別以葡萄糖和乙酸鈉為有機(jī)物時(shí)系統(tǒng)對(duì)氨氮的去除量分別為31.1、15.0mg/L，乙酸鈉對(duì)厭氧氨氧化的抑制更強(qiáng)烈；劉常敬等通過(guò)連續(xù)流和血清瓶批式實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從TN去除率來(lái)看，在苯甲酸鈉、鄰苯二酚、間苯二酚、丙酸鈉、乙酸鈉5種有機(jī)物中，乙酸鈉對(duì)耦合反應(yīng)器的影響最大，TN去除率最低；而張?jiān)姺f等在厭氧氨氧化與反硝化協(xié)同脫氮的研究中，提高有機(jī)物乙酸鈉濃度后，出水NH4+-N濃度大幅上升，厭氧氨氧化細(xì)菌活性大大降低。

2.2 微生物觀察和菌屬分析

2.2.1 各階段顆粒污泥形貌變化

圖4為各階段顆粒污泥的照片。階段A顆粒污泥呈鮮艷的磚紅色，從階段B至階段D，顆粒污泥黑色區(qū)域逐漸增加。顆粒污泥的粒徑也隨著有機(jī)物濃度的增加而逐漸減小，這與以葡萄糖為碳源時(shí)的結(jié)果相同。

2.2.2 微生物高通量測(cè)序結(jié)果分析

圖5（a）和（c）為R1和R3顆粒污泥在門(mén)水平上的菌群分布特性。在2個(gè)樣品中Proteobacteria均為優(yōu)勢(shì)菌群，添加有機(jī)物后R3中Proteobacteria的豐度高于R1。Proteobacteria門(mén)中包含大多數(shù)的反硝化細(xì)菌，系統(tǒng)中添加有機(jī)物后，反硝化菌比例增多。而在R3中Planctomycetes和Acidobacteria的占比與R1相比均有所降低，Planctomycetes門(mén)中包含了已知的厭氧氨氧化菌的所有屬，其比例降低也是添加有機(jī)物后反應(yīng)器中厭氧氨氧化活性降低的主要原因。另外，在2個(gè)樣品中Bacteroidetes的比例變化不大，且都含有Chloroflexi和Firmicutes門(mén)。以上6類門(mén)水平的微生物占比之和在2個(gè)樣品中均超過(guò)94%，因此，在本實(shí)驗(yàn)中添加有機(jī)物后，顆粒污泥中的微生物種類在門(mén)水平上變化不大。

圖5（b）和（d）為R1和R3顆粒污泥在屬水平上的菌群分布特性�？芍�，R1和R3顆粒污泥的主要厭氧氨氧化菌屬都為CandidatusKuenenia，所占比例分別為20.42%和2.30%，表明在厭氧氨氧化反應(yīng)器中加入乙酸鈉后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)馴化，并未改變厭氧氨氧化菌屬，原因可能是CandidatusKuenenia菌屬的基質(zhì)耐受力較高。但隨著有機(jī)物濃度的不斷提高，在階段D，CandidatusKuenenia菌屬所占比例均比初始的穩(wěn)定運(yùn)行階段（階段A）有所降低。Liang等在厭氧氨氧化反應(yīng)器中添加乙酸鈉后，CandidatusKuenenia菌的數(shù)量下降明顯，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。

R1中具有反硝化特性的菌屬有Thauera（2.39%）、Thermomonas（0.59%）、Aquabacterium（1.74%）、Longilinea（2.05%）和Ignavibacterium（3.38%）等，相對(duì)豐度較低。與R1相比，R3新增了多種反硝化菌屬，且相對(duì)豐度較高。

根據(jù)細(xì)菌相對(duì)豐度的不同，可將富集的細(xì)菌分為三大類：①所占比例高于13%，稱為富集的優(yōu)勢(shì)菌；②所占比例為1%~13%，稱為富集的主要菌；③所占比例為0.2%~1%，稱為富集的稀有菌。由圖5可知，R1中優(yōu)勢(shì)菌屬為厭氧氨氧化菌屬，R3中優(yōu)勢(shì)菌屬為反硝化菌屬。隨著有機(jī)物的添加，顆粒污泥中反硝化菌所占比例不斷增加，豐度較高，厭氧氨氧化菌處于劣勢(shì)，嚴(yán)重影響了整體脫氮效果，這與系統(tǒng)氮素變化及顆粒污泥外觀變化相一致。

Du等通過(guò)高通量檢測(cè)DEAMOX系統(tǒng)中菌群結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)在門(mén)水平上Proteobacteria一直為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在屬水平上Thauera在整個(gè)菌群中占較大優(yōu)勢(shì)，這與本研究的結(jié)果一致。但在他的研究中，檢測(cè)出的主要厭氧氨氧化菌屬為CandidatusBrocadia，而在本研究中，厭氧氨氧化耦合反硝化系統(tǒng)中的厭氧氨氧化菌屬為CandidatusKuenenia。分析原因，可能是由于反應(yīng)器運(yùn)行方式及進(jìn)水水質(zhì)不同，使得厭氧氨氧化菌屬有所差異。

3、結(jié)論

①當(dāng)?shù)孜飦喯鯌B(tài)氮足量且進(jìn)水中有機(jī)物乙酸鈉濃度為20mg/L時(shí)，厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)良好的耦合脫氮性能，厭氧氨氧化活性受到部分影響。系統(tǒng)對(duì)NH4+-N的去除率和厭氧氨氧化對(duì)NO2--N的去除比例均先升高后降低，NH4+-N去除率為80.28%~98.14%，厭氧氨氧化對(duì)NO2--N的去除比例為76.70%~100%，平均為89.47%。

②當(dāng)?shù)孜飦喯鯌B(tài)氮足量且進(jìn)水中有機(jī)物乙酸鈉濃度為35~50mg/L時(shí)，厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器的耦合脫氮性能明顯下降，厭氧氨氧化活性受到較強(qiáng)的抑制。當(dāng)乙酸鈉濃度為50mg/L、反應(yīng)器運(yùn)行至第120天時(shí)，NH4+-N去除率降至8.74%，厭氧氨氧化過(guò)程的NO2--N去除比例為34.32%。

③穩(wěn)定運(yùn)行期即階段A和以乙酸鈉為有機(jī)物時(shí)運(yùn)行末期即階段D的顆粒污泥中主要厭氧氨氧化菌屬都為CandidatusKuenenia，所占比例分別為20.42%和2.30%。隨著有機(jī)物濃度的增加，顆粒污泥中厭氧氨氧化菌的生物密度逐漸降低，反硝化菌的生物密度逐漸增加，厭氧氨氧化菌處于劣勢(shì)。（來(lái)源：大連市市政設(shè)計(jì)研究院有限責(zé)任公司）