部分亞硝化-厭氧氨氧化（partialnitritation-ANAMMOX，PN/A）顆粒污泥是一種新型自養(yǎng)生物脫氮技術(shù)，其主要利用好氧氨氧化菌（AOB）和厭氧氨氧化菌（AMX）在顆粒內(nèi)外層的協(xié)同共生，將進(jìn)水中氨氮（NH4+-N）大部分轉(zhuǎn)化為氮?dú)獠⑸缮倭肯跛猁}，反應(yīng)式如式（1）和式（2）所示：
PN反應(yīng)：
ANAMMOX反應(yīng)：
與傳統(tǒng)活性污泥法相比，PN/A顆粒污泥具有脫氮效能高、曝氣耗氧量低、不依賴外部碳源和剩余污泥產(chǎn)量少等優(yōu)勢，已廣泛用于垃圾滲濾液、污泥消化液和低C/N污廢水處理領(lǐng)域。例如，采用序批次方式運(yùn)行的荷蘭Nereda®工藝已經(jīng)在全球建成了50多座工程化設(shè)施，日處理能力達(dá)到數(shù)萬至數(shù)十萬噸不等，出水總氮濃度可達(dá)到8mg·L-1以下。在國內(nèi)，河北省某市政污水處理廠利用PN/A顆粒污泥技術(shù)，成功對處理規(guī)模為2.5萬m3·d-1的原AAO系統(tǒng)進(jìn)行了改造升級，并實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定運(yùn)行。與序批次反應(yīng)器相比，連續(xù)流反應(yīng)器具有操作運(yùn)行簡單、池容利用率高和便于現(xiàn)有工藝改造等優(yōu)勢，因而成為目前的研究熱點(diǎn)。
通常認(rèn)為，接種污泥性質(zhì)、反應(yīng)器運(yùn)行模式和操作條件是影響好氧顆粒污泥反應(yīng)器啟動的關(guān)鍵因素。眾多實(shí)驗(yàn)性和模型研究結(jié)果表明，與絮狀污泥相比，接種顆粒污泥能夠更有效地截留功能菌，促進(jìn)形成生態(tài)位分化，從而大幅壓縮連續(xù)流反應(yīng)器的啟動時長。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過接種PN顆粒污泥，并采用高進(jìn)水氨氮負(fù)荷、高水力選擇壓和限制性曝氣策略，可以在150d內(nèi)成功啟動連續(xù)流PN/A顆粒污泥反應(yīng)器。PN/A污泥較長的培養(yǎng)周期主要受制于AMX緩慢的倍增時間（5~11d）和嚴(yán)苛的生長條件。相比之下，PN顆粒污泥可以通過接種活性污泥在30d內(nèi)實(shí)現(xiàn)批量化培養(yǎng)，AOB的大量富集也為AMX創(chuàng)造了適宜的缺氧環(huán)境和充足的亞硝態(tài)氮（NO2--N）供給。因此，PN顆粒污泥可以視為培養(yǎng)PN/A污泥的優(yōu)良前驅(qū)體，目前將其用于連續(xù)流反應(yīng)器的快速啟動仍鮮見報道。
在本研究中，按照不同比例將PN與PN/A顆粒污泥混合接種至完全混合流反應(yīng)器（CSTR）中，通過設(shè)置高氨氮負(fù)荷和高水力選擇壓條件，嘗試啟動全自養(yǎng)脫氮顆粒污泥反應(yīng)器。通過建立反應(yīng)器脫氮效能、顆粒污泥活性與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)性，系統(tǒng)闡述了接種污泥中脫氮功能菌群的重構(gòu)與自適應(yīng)機(jī)制，并提出了一種快速啟動連續(xù)流PN/A反應(yīng)器的可行策略。
1、材料與方法
1.1 反應(yīng)器與接種污泥
本試驗(yàn)采用3個結(jié)構(gòu)相同的CSTR反應(yīng)器（R1、R2和R3），結(jié)構(gòu)如圖1所示。反應(yīng)器的反應(yīng)區(qū)有效容積為1.5L，兩側(cè)設(shè)有氣升內(nèi)回流區(qū)，底部裝有微孔曝氣裝置，提供運(yùn)行時需的溶解氧和水力剪切力，運(yùn)行溫度通過水浴箱控制在（30±2）℃。
接種采用的PN/A顆粒污泥取自實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的全自養(yǎng)脫氮反應(yīng)器，顆粒呈紅棕色，平均粒徑為（1.5±0.2）mm，污泥沉降指數(shù)（SVI5）約26mL·g-1，比總氮去除速率（sNRR，以VSS計(jì)）約為0.2g·（g·d）-1.接種采用的PN顆粒污泥取自進(jìn)水低C/N（2∶1）的序批式反應(yīng)器，顏色呈棕黃色，平均粒徑為（0.8±0.3）mm，SVI5約52mL·g-1，亞硝化積計(jì)速率（以VSS計(jì)）可達(dá)到0.3g·（g·d）-1.
1.2 反應(yīng)器運(yùn)行方法
反應(yīng)器啟動時，按照質(zhì)量比3∶1、1∶1和1∶3將PN/A與PN顆粒污泥混合接種至R1、R2和R3中，初始污泥濃度（MLVSS）控制在5.97g·L-1，如圖1所示。反應(yīng)器進(jìn)水采用人工配置的高氨氮模擬廢水，分別以碳酸氫鈉和氯化銨作為碳氮源，進(jìn)水水質(zhì)組成為：750mg·L-1NaHCO3、200mg·L-1NH4+-N、44mg·L-1KH2PO4、20mg·L-1MgSO4·7H2O、0.15mg·L-1FeCl3·6H2O和1.0mg·L-1的微量元素，pH控制在8.0±0.1.
反應(yīng)器運(yùn)行主要分為兩個階段：在第Ⅰ階段（1~49d），進(jìn)水氮負(fù)荷（NLR）約為2.4kg·（m3·d）-1，水力停留時間（HRT）為2h，控制曝氣通量在0.7~0.9L·（m2·min）-1，反應(yīng)區(qū)DO濃度1.6~1.9mg·L-1.在第Ⅱ階段（50~95d），保持進(jìn)水NH4+-N濃度不變，縮短HRT至1.5h，NLR提高至3.2kg·（m3·d）-1，將曝氣通量調(diào)至1.1L·（m2·min）-1，DO濃度為1.8~2.1mg·L-1.反應(yīng)器運(yùn)行期間不排泥，平均泥齡約為45d。
1.3 分析方法
NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TN和MLVSS濃度分別采用納氏試劑光度法、紫外分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺光度法、過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法和標(biāo)準(zhǔn)重量法測定。SVI5值采用國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法測定。
使用帶高清攝像頭的光學(xué)顯微鏡觀察污泥形態(tài)。粒徑分布采用篩分法測算。定期從反應(yīng)器中取出污泥樣品，經(jīng)生理鹽水反復(fù)清洗后，依次通過孔徑1.60、1.25、0.80、0.50和0.20mm的分樣篩，并計(jì)算各粒徑區(qū)間樣品所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
f值是判斷PN/A反應(yīng)的重要計(jì)量學(xué)指標(biāo)，計(jì)算見式（3）：
式中，Δc（NO3--N）和Δc（NH4+-N）分別為反應(yīng)器進(jìn)出水中NO3--N和NH4+-N濃度差的絕對值，mg·L-1；由式（1）和式（2）可知，f的理論值為0.11.
1.4 微生物高通量測序分析
采集接種污泥（PN0和PNA0）和第95d不用反應(yīng)器中的污泥樣品（R1、R2和R3），利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，選擇16SrRNA中338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為細(xì)菌特征引物，使用20μL混合反應(yīng)體系，在ABIGeneAmp®9700型PCR擴(kuò)增儀上完成目標(biāo)片段擴(kuò)增。隨后，基于IlluminaMiSeqPE300平臺，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，并進(jìn)行細(xì)菌分類學(xué)等相關(guān)分析。27個樣本的基因序列平均長度為441bp，以97%的相似性截取對操作單元（OTU）進(jìn)行聚類。每個16SrRNA基因序列的分類通過USEARCH7-uparse算法與silva128/16s_bacteria數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，分類置信度為0.7.基于觀察到的OTU，使用Uparse軟件計(jì)算OTU豐富度（ACE指數(shù)）和α多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)），并進(jìn)行（PCA）主成分坐標(biāo)分析。在門和屬水平上，比較不同樣品菌群結(jié)構(gòu)的差異性，并且對顆粒污泥主要功能菌種相對豐度進(jìn)行分析。
2、結(jié)果與討論
2.1 反應(yīng)器的脫氮性能
3個連續(xù)流反應(yīng)器的啟動運(yùn)行情況如圖2所示。在第1~10d，控制曝氣通量在0.7L·（m2·min）-1，R1出水中ρ（NO2--N）逐步從9.02mg·L-1降至5.81mg·L-1，NH4+-N和TN去除率分別升至63.1%和54.4%，顆粒污泥表現(xiàn)出較高的自養(yǎng)脫氮性能，并產(chǎn)生少量NO3--N。與之相比，更高的PN污泥接種比使得R2和R3呈現(xiàn)明顯的亞硝化特征，出水中NO2--N濃度都經(jīng)歷了一個“先升后降”的波動過程。運(yùn)行至第10d，R2和R3的NH4+-N去除率分別為52.0%和53.5%，但TN去除率仍低于40%。在第10~49d，反應(yīng)器單位曝氣通量調(diào)高至0.9L·（m2·min）-1，R1、R2和R3出水中的ρ（NO2--N）分別降至3.8、3.8和13.2mg·L-1，TN去除率逐步提高至80.7%、79.3%和74.5%。
在第50d，通過縮短HRT和調(diào)高曝氣量，增大反應(yīng)器NLR和溶解氧供給（水力剪切），以強(qiáng)化顆粒污泥的脫氮性能。R1和R2在經(jīng)歷沖擊后，TN去除率在第70d后趨于穩(wěn)定，分別達(dá)到（82.4±2）%和（80.7±2）%。R3出水中ρ（NH4+-N）、ρ（NO3--N）和ρ（NO2--N）濃度在第80d后趨于穩(wěn)定，均值分別為17.0、2.3和21.0mg·L-1，TN去除率達(dá)到（79±2）%。需要注意的是，本研究在CSTR出水中保留了充足的剩余ρ（NH4+-N）（>12.9mg·L-1），保證AOB和AMX對NOB的生長競爭優(yōu)勢。在第95d，R1~R3的TN去除負(fù)荷達(dá)到2.6~2.7kg·（m3·d）-1，f值約為0.10±0.02，接近PN/A反應(yīng)的理論值。這表明3個連續(xù)流PN/A顆粒污泥反應(yīng)器已成功啟動。顆粒污泥反應(yīng)器脫氮性能與已有研究報道結(jié)果的對比如表1所示。
2.2 粒徑分布與污泥活性變化
在啟動初始階段，R1中污泥的平均粒徑和比總氮去除率（以VSS計(jì)）分別為1.13mm和0.15g·（g·d）-1，遠(yuǎn)大于R2和R3的對應(yīng)值（圖3）。當(dāng)運(yùn)行至第50d，3個反應(yīng)器中污泥量和sNRR均有所增長，其中，R2的ρ（MLVSS）最大，達(dá)到6.78g·L-1，SVI5值保持在21~33mL·g-1的水平。同期，R3中粒徑0.5~0.8mm的污泥占比由最初的51%大幅下降至24%，并出現(xiàn)了粒徑>1.6mm的顆粒污泥（約10%），污泥平均粒徑較接種污泥增大了約17.6%，增幅高于R2的9.4%和R1的3.5%。這意味著接種污泥在高水力剪切的作用下發(fā)生了顆粒破碎、表面剝落、小顆粒聚集和生長過程，顆粒粒徑的增大將有利于促進(jìn)微生物生境的分化，提高物種及其功能的多樣性。Zhu等通過綜合分析顆粒內(nèi)部傳質(zhì)、功能菌富集和污泥沉降性等因素，認(rèn)為處理低濃度廢水時，好氧顆粒污泥的最佳粒徑范圍在0.5~0.9mm。在本研究中，粒徑在0.5~1.25mm的顆粒污泥始終占據(jù)主導(dǎo)地位。
在第Ⅱ階段，隨著NLR提高至3.2kg·（m3·d）-1，反應(yīng)器內(nèi)污泥量和sNRR進(jìn)一步增長。在第95d，R1~R3中ρ（MLVSS）分別達(dá)到7.3、7.8和7.2g·L-1，sNRR分別較接種污泥提高了約2.4、3.9和9.5倍。從形態(tài)上看，3個反應(yīng)器中污泥的平均粒徑在1.22~1.27mm，粒徑分布總體服從正態(tài)分布。顆粒呈現(xiàn)PN/A污泥所特有的棕紅色，表層較內(nèi)核更為松散，有利于氮素、溶解氧和氮?dú)獾碾p向傳質(zhì)。
2.3 污泥菌群結(jié)構(gòu)對比分析
采用高通量測序技術(shù)對不同污泥樣品中的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。盡管PN0與PNA0存在功能性差異，但R1~R3中顆粒污泥在相同條件下培養(yǎng)95d后獲得了類似的菌群結(jié)構(gòu)，如圖4所示。在OTU水平上，R1~R3中顆粒污泥的微生物豐度（Ace指數(shù)）和生物多樣性（Shannon指數(shù)）均明顯高于接種污泥，擁有與PNA0和PN0相同的OTU數(shù)量分別為236個（占比為49.7%~53.6%）和143個（占比為30.1%~32.5%）。這表明功能菌群在反應(yīng)器啟動期間發(fā)生了重構(gòu)和演化，以適應(yīng)高NLR、高水力剪切和高水力選擇壓的運(yùn)行條件。
如圖5（a）所示，R1~R3中顆粒污泥中相對豐度前5的菌門分別為浮霉菌門（Planctomycetes）（23.0%~28.8%）、變形菌門（Proteobacteria）（26.2%~40.0%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（10.3%~16.3%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（10.9%~16.7%）和綠菌門（Chlorobi）（3.1%~4.3%）。與Proteobacteria（50.5%）和Bacteroidetes（30.0%）占主導(dǎo)的PN0相比，R1~R3污泥的菌群結(jié)構(gòu)與PNA0具有更高的相似度。作為PN/A反應(yīng)的核心功能菌，隸屬于Planctomycetes菌門的CandidatusKuenenia屬是PNA0中主要的AMX菌屬（30.78%）。同時，接種PN0顆粒污泥為反應(yīng)器提供了充足的AOB菌種（Nitrosomonas屬），有利于AMX在顆粒污泥中的富集。如圖5（b）所示，Nitrosomonas和CandidatusKuenenia在R1~R3污泥中的相對豐度分別達(dá)到了1.5%~2.4%和23.6%~37.6%。另外，R1~R3污泥中還檢出了少量r型-AMX菌屬（CandidatusBrocadia，0.3%~0.5%），這可能與反應(yīng)器啟動初期的亞硝累積過程有關(guān)。與CandidatusKuenenia屬相比，CandidatusBrocadia在高基質(zhì)濃度（如NO2--N）條件下的生長速率更快，并具備更強(qiáng)的小分子有機(jī)酸代謝能力。值得注意的是，R1~R3污泥中并未檢出亞硝酸鹽氧化菌（NOB），這說明維持剩余NH4+-N濃度有效抑制了NOB在顆粒污泥中的生長，有利于維持連續(xù)流反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行。
盡管R1~R3反應(yīng)器進(jìn)水中不含有機(jī)碳，但Chloroflexi、Bacteroidetes和Chlorobi等異養(yǎng)菌門在PN/A顆粒污泥中的生長仍是普遍現(xiàn)象，可形成復(fù)雜的種間代謝基質(zhì)（如碳氮源、氨基酸和維生素等）傳遞和利用網(wǎng)絡(luò)，例如，隸屬于Chloroflexi門的norank_f_Anaerolineaceae在R1~R3污泥中的相對豐度達(dá)到了4.8%~10.4%，其主要通過水解細(xì)胞殘體（SMP）和胞外聚合物質(zhì)（EPS）獲取生長基質(zhì)，對維持顆粒污泥的穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用。同時，Denitratisoma和norank-f-PHOS-HE36等反硝化菌（HDB）的檢出表明，厭氧氨氧化反應(yīng)并不是顆粒污泥中唯一的生物脫氮路徑。通常認(rèn)為，污泥水解提供的內(nèi)源有機(jī)碳不足以驅(qū)動完全反硝化過程（NO3-→NO2-→N2O→N2），這使得HDB優(yōu)先將NO3--N還原為AMX生長所需的NO2--N，實(shí)現(xiàn)部分反硝化功能。此外，有研究者基于宏基因和宏轉(zhuǎn)錄測序分析提出，Chlorobi與AMX存在密切的共生關(guān)系，一方面，AMX向Chlorobi提供其無法合成的基質(zhì)，如醋酸鹽、b族維生素和EPS（氨基酸、肽），另一方面，Chlorobi可以從AMX處獲得次級代謝產(chǎn)物和氨基酸等。
2.4 混合接種的工程應(yīng)用潛力
在本研究中，按照不同質(zhì)量比混合接種PN/A和PN顆粒污泥，成功啟動了連續(xù)流自養(yǎng)生物脫氮工藝，TN去除負(fù)荷達(dá)到2.6kg·（m3·d）-1以上，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)活性污泥法的水平。在此期間，PN顆粒污泥不僅為反應(yīng)器提供了充足的AOB菌種和AMX生長所需的限制性基質(zhì)（NO2--N），還可以通過顆粒間碰撞獲得AMX菌種，并逐步形成穩(wěn)定的PN/A顆粒結(jié)構(gòu)，如圖6所示。在CSTR反應(yīng)器中，單個PN/A顆粒污泥都可被視為一個微型的污水處理單元，AOB集中分布于顆粒表面0~150μm的外層，而AMX則占據(jù)表層以下300~700μm的內(nèi)核區(qū)域。在水力剪切的作用下，顆粒之間的碰撞、摩擦或表層剝離都可能破壞AOB和AMX的分層結(jié)構(gòu)。作為培養(yǎng)PN/A顆粒污泥的前驅(qū)體，PN顆粒污泥表面存在穩(wěn)定的溶氧梯度，并能夠?yàn)?/span>AMX生長提供充足的NH4+-N和NO2--N供給，經(jīng)過新的污泥顆�；^程，就可以形成泥齡更短、活性更高的微生物聚集體。
有研究表明，采用高水力選擇壓的生化反應(yīng)器，如大高徑比（H/D為8~12）的序批式反應(yīng)器和短HRT、高污泥截留的連續(xù)流反應(yīng)器，能夠在7~21d內(nèi)同步實(shí)現(xiàn)活性污泥的亞硝化和顆�；ＥcPN/A污泥相比，PN顆粒污泥的批量化培養(yǎng)難度明顯更低。在工程化應(yīng)用中，將PN顆粒污泥與PN/A污泥混合接種是快速啟動連續(xù)流反應(yīng)器的有效方法，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。
3、結(jié)論
（1）當(dāng)NLR為2.4kg·（m3·d）-1時，R1和R2連續(xù)運(yùn)行至第49d，TN去除率均可達(dá)到80%以上，而R3表現(xiàn)出更明顯的亞硝化特性。通過同步提高NLR和曝氣強(qiáng)度，R1、R2和R3在運(yùn)行至第95d時，TN去除負(fù)荷達(dá)到2.6kg·（m3·d）-1以上，f值接近理論值0.11.連續(xù)流PN/A顆粒污泥反應(yīng)器成功啟動。
（2）在反應(yīng)器啟動期間，顆粒污泥濃度和脫氮活性均持續(xù)提高。運(yùn)行至第95d，R1~R3中污泥的ρ（MLVSS）、平均粒徑和sNRR值（以VSS計(jì)）分別達(dá)到了7.1~7.8g·L-1、1.22~1.27mm和0.35~0.39g·（g·d）-1。盡管R3中顆粒污泥的平均粒徑和脫氮活性增幅最大，但PN/A與PN顆粒污泥的接種比并未顯著影響反應(yīng)器在穩(wěn)定狀態(tài)下的脫氮性能。
（3）高通量測序結(jié)果表明，R1~R3中顆粒污泥的微生物豐度和多樣性指數(shù)均明顯高于接種污泥。在顆粒污泥中，AOB（Nitrosomonas屬）和AMX（CandidatusKuenenia和Brocadia屬）是驅(qū)動PN/A自養(yǎng)脫氮的核心菌群，同時，Chloroflexi、Bacteroidetes和Chlorobi等異養(yǎng)菌的協(xié)同生長也為增強(qiáng)顆粒功能結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)揮了重要作用。啟動期間，PN顆粒污泥充當(dāng)了培養(yǎng)PN/A污泥的前驅(qū)體，因此，混合接種策略對快速啟動連續(xù)流自養(yǎng)脫氮工藝具有較高的工程指導(dǎo)意義。（來源：蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，城市生活污水資源化利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，蘇州太湖中法環(huán)境技術(shù)有限公司）
