近年來，抗生素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和畜牧業(yè)，根據(jù)2000年—2018年的研究，全球抗生素消耗量增長了46%，其中青霉素類、磺胺類和喹諾酮類等抗生素主要在發(fā)展中國家被廣泛使用，2000年—2010年的使用量增長了36%�？股氐臑E用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，加劇了抗性基因（ARGs）在生態(tài)環(huán)境中的傳播，對(duì)公眾健康構(gòu)成威脅。硝化污泥系統(tǒng)可以通過氨氧化微生物的共代謝作用有效去除多種藥理活性化合物（PhACs），包括抗生素、雌激素、阿替洛爾等。氨氧化微生物以氨氧化細(xì)菌（AOB）為主，其分泌的一種非特異性酶（氨單加氧酶），可以將氨氧化成羥胺的同時(shí)有效降解抗生素。但是抗生素廢水的條件經(jīng)常發(fā)生波動(dòng)，比如鹽度、pH、溫度等，而硝化污泥系統(tǒng)對(duì)抗生素的降解效果易受到這些因素的影響，進(jìn)而影響ARGs的豐度。目前，在硝化污泥系統(tǒng)去除抗生素的過程中，關(guān)于鹽度對(duì)ARGs影響的研究較少。為此，筆者以一種廣泛使用的磺胺類抗生素磺胺嘧啶（SDZ）為研究對(duì)象，探究鹽度對(duì)硝化污泥系統(tǒng)去除抗生素效能的影響，并分析不同鹽度下系統(tǒng)中ARGs豐度以及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。
1、材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)接種污泥取自濟(jì)南光大水務(wù)小清河污水處理廠二沉池中的回流污泥。試驗(yàn)進(jìn)水采用模擬廢水，SDZ濃度為5.0mg/L，其他組分如下：氯化銨為191mg/L、磷酸氫二鉀為58mg/L、磷酸二氫鉀為24mg/L、二水合氯化鈣為67mg/L、結(jié)晶硫酸鎂為42mg/L、碳酸氫鈉為1000mg/L。廢水中加入微量元素溶液，以保證微生物正常生長，其組分如下：氯化鐵為1500mg/L、硼酸為150mg/L、五水合硫酸銅為30mg/L、碘化鉀為30mg/L、四水合氯化錳為120mg/L、二水合鉬酸鈉為60mg/L、七水合硫酸鋅為120mg/L、六水合氯化鈷為150mg/L。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 污泥馴化
由于接種污泥中硝化細(xì)菌的含量和活性均較低，因此，試驗(yàn)開始時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行馴化，馴化總周期為30d。試驗(yàn)裝置如圖1所示，采用圓柱形SBR反應(yīng)器，有效容積為4L，體積交換比為1∶1。反應(yīng)器為全自動(dòng)運(yùn)行，每個(gè)運(yùn)行周期為6h，其中進(jìn)水30min、曝氣270min、污泥沉降30min、出水10min、靜置20min，每天運(yùn)行4個(gè)周期。
試驗(yàn)采用好氧曝氣，并采取連續(xù)增加進(jìn)水負(fù)荷的方法來馴化污泥，最終使得進(jìn)水氨氮濃度控制在50mg/L。馴化過程中需要對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行定期排泥，以保證污泥濃度基本維持在4000mg/L。當(dāng)系統(tǒng)出水水質(zhì)穩(wěn)定、NH4+-N基本被完全去除且無NO2--N積累時(shí)，表明硝化污泥馴化完成。
1.2.2 硝化污泥系統(tǒng)性能研究
試驗(yàn)設(shè)置4組平行的SBR反應(yīng)器（S1~S4），將馴化完成后的污泥放至反應(yīng)器中，并控制每個(gè)反應(yīng)器的污泥濃度在4000mg/L左右。反應(yīng)器的運(yùn)行參數(shù)與污泥馴化階段一致。通過控制NaCl的添加量使反應(yīng)器S1~S4的進(jìn)水鹽度分別為0、0.5%、1.0%、2.0%，反應(yīng)器運(yùn)行30d，分別在第1、5、10、15、20、25、30天測(cè)定出水NH4+-N、NO3--N、NO2--N以及SDZ濃度，考察不同鹽度下系統(tǒng)的硝化效果以及對(duì)SDZ的去除效果。其中，NH4+-N、NO3--N、NO2--N濃度均采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定，SDZ濃度采用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。
1.2.3 amoA、ARGs和微生物群落分析
已有研究證實(shí)，在氨存在的情況下，AOB的共代謝降解是去除SDZ的主要機(jī)制，亞硝酸鹽氧化菌（NOB）的貢獻(xiàn)很小。amoA基因的表達(dá)量可以作為AOB活性的生物標(biāo)志物，水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）和微生物群落是影響ARGs豐度的兩個(gè)重要因素，因此在試驗(yàn)運(yùn)行30d后提取不同鹽度反應(yīng)器的污泥樣本DNA進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，探究每個(gè)階段污泥中amoA基因、整合子基因（intI1，水平轉(zhuǎn)移的指示性基因）、ARGs（sul1、sul2）和細(xì)菌的16SrRNA基因豐度的變化情況，并分析不同鹽度條件下硝化污泥系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí)對(duì)ARGs、intI1和微生物群落豐度進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，確定ARGs豐度的變化機(jī)制。其中宿主菌的識(shí)別依據(jù)是相關(guān)性的顯著性系數(shù)（p值），當(dāng)p<0.05時(shí)為顯著相關(guān)，即認(rèn)為該菌是ARGs的宿主菌。相關(guān)性分析由SPSS軟件完成，微生物群落與ARGs的相關(guān)性熱圖由Origin軟件完成。
2、結(jié)果與討論
2.1 SDZ的去除
不同鹽度條件下硝化污泥系統(tǒng)對(duì)SDZ的去除效果如圖2所示。在無鹽度條件下，在生物降解的最初10d，反應(yīng)器對(duì)SDZ的去除率呈升高趨勢(shì)，并在第10天達(dá)到最佳去除效果，而后趨于穩(wěn)定（平均去除率為93.37%），這種現(xiàn)象與硝化污泥對(duì)抗生素的適應(yīng)性有關(guān)。隨著進(jìn)水鹽度的增加，硝化污泥系統(tǒng)對(duì)SDZ的去除率逐漸降低。當(dāng)進(jìn)水鹽度分別為0.5%、1.0%和2.0%時(shí)，第10天時(shí)對(duì)SDZ的去除率分別為94.3%、71.2%和42.3%。此外，鹽度由0.5%增加到2.0%時(shí)，出水SDZ濃度由0.276mg/L增加到2.804mg/L。該結(jié)果表明，長期暴露在鹽度沖擊負(fù)荷環(huán)境下，硝化污泥對(duì)抗生素的生物降解能力受到影響，降解能力隨著鹽度的增加而逐漸降低，這也說明在高鹽度下微生物活性較低。
2.2 鹽度對(duì)硝化污泥系統(tǒng)性能的影響
不同鹽度下硝化污泥系統(tǒng)的性能如圖3所示。
在未添加NaCl的反應(yīng)器S1中，NH4+-N能夠被快速去除，平均去除率可達(dá)99%。當(dāng)鹽度由0.5%增加到1.0%時(shí)，NH4+-N的平均去除率稍微降低（由98.97%降至82.06%），而當(dāng)鹽度增加到2.0%時(shí)，NH4+-N的平均去除率急劇下降，僅為54.88%。該結(jié)果表明高鹽度對(duì)反應(yīng)器的硝化性能有顯著影響，這是由于AOB對(duì)鹽度敏感，在高鹽環(huán)境中生長緩慢，氨氧化活性被抑制，從而導(dǎo)致NH4+-N去除率降低。
在未添加NaCl的反應(yīng)器S1中，大部分NH4+-N轉(zhuǎn)化為NO3--N（平均濃度為48.63mg/L），幾乎沒有出現(xiàn)NO2--N的積累，說明系統(tǒng)硝化性能良好。而當(dāng)進(jìn)水鹽度為1.0%和2.0%時(shí)，NO2--N濃度有所升高，NO3--N濃度降低，尤其是當(dāng)鹽度為2.0%時(shí)，NO2--N平均濃度增至3.63mg/L，而NO3--N平均濃度僅為26.09mg/L，這是由于在此鹽度下AOB和NOB活性均受到一定程度的抑制。綜上所述，在較低鹽度（0.5%）條件下硝化污泥系統(tǒng)的硝化性能較好，但是當(dāng)鹽度升高時(shí)（1.0%和2.0%），系統(tǒng)的硝化性能會(huì)受到不同程度的抑制。
2.3 鹽度對(duì)硝化污泥系統(tǒng)中微生物群落的影響
2.3.1 amoA基因的相對(duì)表達(dá)
amoA基因的表達(dá)受到了鹽度沖擊的影響。amoA基因的豐度在未投加NaCl的初始污泥中最高，為6.45×10-6copies（以16SrRNA為標(biāo)準(zhǔn)，下同）。投加NaCl之后，amoA基因的豐度隨著鹽度的增加而逐漸降低，當(dāng)鹽度增至2.0%時(shí)其豐度最低，為2.42×10-6copies。這表明鹽度對(duì)硝化污泥系統(tǒng)中amoA基因的表達(dá)具有顯著的抑制作用，鹽度沖擊負(fù)荷越大，系統(tǒng)內(nèi)AOB活性受到的抑制作用也越大，這與高鹽度下NH4+-N去除率下降的結(jié)果一致。
2.3.2 屬水平上的菌群變化
運(yùn)行30d后，不同鹽度下硝化污泥系統(tǒng)中微生物菌群在屬水平上的分布情況如圖4所示。
從圖4可以看出，隨著進(jìn)水鹽度的增加，相對(duì)豐度排名前30之外的其他菌種豐度逐漸升高，說明鹽度的沖擊降低了物種分布的均勻程度。在硝化污泥系統(tǒng)中，AOB和異養(yǎng)菌均參與抗生素的去除過程。Nitrospiraceae作為常見的AOB，它所分泌的氨單加氧酶可以共代謝降解多種抗生素。圖4顯示，unidentified_Nitrospiraceae的相對(duì)豐度隨鹽度的升高而逐漸降低，這與amoA基因的表達(dá)變化一致。除了AOB，多種異養(yǎng)菌也被檢測(cè)到，如動(dòng)膠菌屬（Zoogloea）、氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）和陶厄氏菌屬（Thauera）等。其中，Zoogloea、Hydrogenophaga均具有降解有機(jī)物和有毒物質(zhì)的能力，Thauera具有降解芳香族污染物的能力，因此它們對(duì)磺胺嘧啶也具有一定的生物降解作用。另外發(fā)現(xiàn)，Zoogloea、Hydrogenophaga和Thauera的相對(duì)豐度在鹽度為2.0%時(shí)大幅降低，這是由于高鹽度會(huì)顯著影響細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能，并在一定程度上抑制其活性。綜上，高鹽度抑制了抗生素降解菌的活性，進(jìn)而導(dǎo)致抗生素去除率降低。
2.4 鹽度沖擊下ARGs的變化
在硝化污泥系統(tǒng)中，ARGs的傳播機(jī)制仍不明確，鹽度對(duì)ARGs的影響也有待研究。因此，本研究通過4個(gè)SBR反應(yīng)器研究了不同鹽度條件下ARGs的豐度，結(jié)果如圖5所示。添加NaCl后，sul1和sul2的豐度隨著鹽度的提高而逐漸降低，但均比無鹽度條件下要高，其中，當(dāng)鹽度為0.5%時(shí)，各基因的豐度均達(dá)到最大值，sul1和sul2的豐度分別為3.79×10-4、2.97×10-4copies，這表明低鹽度的沖擊促進(jìn)了ARGs的增殖。
為了進(jìn)一步確定ARGs的變化機(jī)制，對(duì)intI1、sul1和sul2進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，sul1、sul2與intI1基因顯著相關(guān)，表明水平基因轉(zhuǎn)移促進(jìn)了ARGs的傳播。另外，對(duì)微生物群落和sul1、sul2進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6所示（“*”表示在p<0.05水平上相關(guān)性顯著）。可知，Plasticicumulans、Sulfuritalea和Brevumdimonas是sul1和sul2的宿主菌。因此，水平轉(zhuǎn)移和微生物群落結(jié)構(gòu)變化均會(huì)導(dǎo)致ARGs的變化，即0.5%鹽度條件下較高的sul1、sul2豐度一方面是由水平基因轉(zhuǎn)移（較高的intI1豐度）導(dǎo)致；另一方面，Plasticicumulans、Sulfuritalea以及Brevumdimonas在0.5%鹽度下較高的豐度也使得sul1和sul2豐度升高。
3、結(jié)論
①無鹽度時(shí)硝化污泥能夠高效去除SDZ，平均去除率可達(dá)93.37%，而高鹽度會(huì)抑制抗生素降解菌的活性，進(jìn)而導(dǎo)致抗生素去除率降低。
②較低鹽度（0.5%）時(shí)硝化污泥系統(tǒng)的脫氮性能較好，NH4+-N去除率高達(dá)99%。但是當(dāng)鹽度升高（1.0%和2.0%）時(shí)，AOB和NOB活性受到抑制，系統(tǒng)的硝化效果降低。
③NaCl的投加促進(jìn)了ARGs的增殖，在較低鹽度（0.5%）時(shí)ARGs豐度最高，這是水平基因轉(zhuǎn)移和微生物群落變化共同作用的結(jié)果。（來源：山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東建筑大學(xué)資源與環(huán)境創(chuàng)新研究院）
