1 引言(Introduction)

　　隨著農(nóng)村畜禽養(yǎng)殖業(yè)從個(gè)體散養(yǎng)走向集約化養(yǎng)殖, 畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生的廢物已經(jīng)成為我國農(nóng)村環(huán)境污染的主要來源之一.集約化豬場(chǎng)每百頭豬每天產(chǎn)生的廢水可高達(dá)2~3 m3.據(jù)國家環(huán)保局統(tǒng)計(jì), 2002年我國畜禽糞便產(chǎn)生量達(dá)27.5億t, 畜禽糞便每年流失至水體的總氮和總磷分別為87萬t和34.5萬t.規(guī)�；�畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)生的污水通常采用沼氣池厭氧發(fā)酵處理, 以求資源化利用發(fā)酵產(chǎn)生的沼氣.但與此同時(shí)產(chǎn)生的大量沼液中仍然含有高濃度的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽.經(jīng)過沼氣池發(fā)酵處理的豬場(chǎng)沼液具有兩大特點(diǎn)：一是氨氮濃度高且是污水中的主要氮源;二是污水中氮、磷濃度差異大.經(jīng)對(duì)豬場(chǎng)沼液的周年監(jiān)測(cè), 發(fā)現(xiàn)原始沼液中總氮濃度可高達(dá)800 mg·L-1, 氨氮濃度超過700 mg·L-1, 總磷超過3 mg·L-1.將其直接排放到水體中會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化, 破壞水域生態(tài)系統(tǒng)平衡.在2014年最新的《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》頒發(fā)及人們對(duì)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量要求提升的大背景下, 高效的畜禽糞污無害化處理技術(shù)對(duì)實(shí)現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)文明具有重要的意義, 尋找高效的沼液綜合利用技術(shù)和沼液無害化處理技術(shù)顯得尤為急迫.

　　微藻細(xì)胞能以光為能源, 從水體中吸收硝態(tài)氮、氨態(tài)氮及磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞, 從而降低水體中的氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽.同時(shí), 生成的微藻細(xì)胞又可用于飼料、新能源生產(chǎn)等多種用途.因此, 微藻作為畜禽養(yǎng)殖污水的生物處理及資源化利用的載體近來備受關(guān)注.已有研究表明, 利用污水中的氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽培養(yǎng)微藻, 能有效去除污水中的氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽, 實(shí)現(xiàn)環(huán)境保護(hù)及資源的循環(huán)利用.Wang等(2010)將小球藻(Chlorella sp.)接種到厭氧分解后的牛糞污水中, 經(jīng)21 d可去除76%~83%的總氮和63%~75%的總磷.Zhang等(2008)發(fā)現(xiàn), 固定化柵藻(Scenedesmus sp.)對(duì)污水中氮磷的去除率最高達(dá)100%.劉林林等(2014)發(fā)現(xiàn), 狹形小樁藻(Characium angustum)SHOU-F87在豬場(chǎng)養(yǎng)殖污水中可以去除64%的總氮和96%的總磷.不同微藻對(duì)水體中的氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽的耐受、吸收和利用能力不同(劉林林等, 2014).當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽水平足以滿足浮游植物生長(zhǎng)時(shí), 浮游植物對(duì)氮磷的吸收基本按照Redfield比例(N:P=16:1) 進(jìn)行(Redfield, 1958).而豬場(chǎng)養(yǎng)殖污水經(jīng)厭氧發(fā)酵后形成的沼液中, 氮磷濃度極度不平衡, 尤其是氨態(tài)氮濃度高, 而總磷濃度低.極高的氮磷比遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離藻類生長(zhǎng)的正常需求, 不符合微藻的最適生長(zhǎng)條件.盡管利用微藻凈化污水的研究已有大量報(bào)道, 但在污水中補(bǔ)充限制性磷鹽以提高微藻生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收效率的研究尚少.本試驗(yàn)所用綠球藻(Chlorococcum sp.)是一株從豬場(chǎng)養(yǎng)殖污水中分離出的藻株, 對(duì)污水環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng).穆亮亮等(2016)研究發(fā)現(xiàn), 此株綠球藻具有耐高溫的特性, 在培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí), 藻細(xì)胞密度和油脂含量最高, 且可以耐受40 ℃高溫.

　　因此, 本文通過研究該株綠球藻在添加不同濃度磷的污水中生長(zhǎng)及凈化污水的特點(diǎn), 以期尋找到綠球藻在污水中生長(zhǎng)較好且去除氮、磷效率較高的最適氮磷比.

　　2 材料和方法(Materials and methods)2.1 試驗(yàn)材料2.1.1 藻種來源

　　試驗(yàn)藻株分離自浙江嘉興余新鎮(zhèn)敦好農(nóng)牧有限公司露天沼液存貯池, 在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行純化并逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后用于本試驗(yàn), 該藻種經(jīng)顯微鏡鑒定為綠球藻屬(Chlorococcum sp.).

　　2.1.2 試驗(yàn)污水

　　試驗(yàn)用沼液取自上海市光明集團(tuán)明錦畜牧有限公司的養(yǎng)豬場(chǎng), 沼液經(jīng)沉淀處理后, 再經(jīng)500目篩網(wǎng)過濾, 并用自來水稀釋至氨氮濃度約為300 mg·L-1后用于本試驗(yàn).

　　2.2 試驗(yàn)方法

　　在氨氮濃度約為300 mg·L-1的污水中, 添加不同量的NaH2PO4以調(diào)節(jié)污水N:P配制成可溶性氮、磷物質(zhì)的量濃度比分別為8:1、16:1、32:1和64:1的系列污水, 以不添加NaH2PO4的原污水作為對(duì)照組(N:P比約為532:1).各組水質(zhì)指標(biāo)如表 1所示.將預(yù)先擴(kuò)大培養(yǎng)的綠球藻離心收集藻細(xì)胞, 然后將收集的藻細(xì)胞分別接種到裝有1000 mL不同氮磷比污水的錐形瓶中, 初始接種密度為400×104 cells·mL-1, 每組設(shè)置3個(gè)平行.將綠球藻置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng), 溫度35 ℃, 光照3000 lx, 光照周期為24 L:0 D(24 h光照, 0 h黑暗).每天定時(shí)搖瓶3次, 隔天用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度, 每隔2 d測(cè)定培養(yǎng)水體中氮、磷變化情況.試驗(yàn)進(jìn)行12 d, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集藻細(xì)胞測(cè)量生物量干重.

　　表 1 試驗(yàn)用污水的水質(zhì)指標(biāo)狀況

　　2.3 指標(biāo)檢測(cè)

　　采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定藻細(xì)胞密度, 并采用式(1) 計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)率K(成永旭, 2005).

　　式中, N0為培養(yǎng)初始藻細(xì)胞密度(cells·mL-1), Nt為培養(yǎng)t天后的藻細(xì)胞密度(cells·mL-1), t為培養(yǎng)時(shí)間(d).

　　培養(yǎng)水體經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾后進(jìn)行檢測(cè), 參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第4版)》(國家環(huán)境保護(hù)總局, 2002)測(cè)定水樣中氮、磷水平.其中, 氨態(tài)氮測(cè)定采用納氏試劑分光光度法;硝態(tài)氮測(cè)定采用紫外分光光度法;總氮測(cè)定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法;總磷測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法.

　　氮、磷去除率r的計(jì)算見式(2)(劉林林等, 2014).

　　式中, C0和Ct分別為初始氮、磷的濃度和培養(yǎng)t天后的濃度(mg·L-1).

　　培養(yǎng)結(jié)束后, 每組取80 mL藻液經(jīng)預(yù)先恒重過的0.45 μm微孔濾膜抽濾, 將濾膜置于鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃烘至恒重, 計(jì)算生物量干重B (穆亮亮, 2016)：

　　式中, W0為預(yù)恒重過的0.45 μm微孔濾膜的質(zhì)量(g), W1為恒重過后0.45 μm微孔濾膜+藻泥的總質(zhì)量(g), V為抽濾的藻液體積(L).

　　2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

　　結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較, 以 p<0.05表示差異顯著.

　　3 結(jié)果(Results)3.1 綠球藻在不同氮磷比污水中的生長(zhǎng)狀況

　　不同氮磷比污水中綠球藻生長(zhǎng)曲線如圖 1所示.由圖可知, 前6 d為指數(shù)生長(zhǎng)期, 之后各組藻細(xì)胞密度趨于平緩后開始下降.在培養(yǎng)8 d后, N:P為8:1、16:1、32:1、64:1處理組和對(duì)照組藻的相對(duì)生長(zhǎng)率分別為0.248、0.256、0.261、0.279和0.244.N:P為64:1組的綠球藻生長(zhǎng)最好, 在第8 d時(shí)藻細(xì)胞密度最高為3646×104 cells·mL-1, 第12 d時(shí)細(xì)胞密度為3393×104 cells·mL-1, 均顯著高于其他組(p < 0.05);其次為32:1和16:1組, 對(duì)照組的細(xì)胞密度最低.

　　圖 1綠球藻在不同氮磷比污水中的生長(zhǎng)曲線

　　培養(yǎng)12 d后, 不同氮磷比污水中綠球藻的生物量干重如圖 2所示, N:P=64:1組藻生物量(以干重計(jì))最高(0.49 g·L-1), 其次為32:1和16:1組, 均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).

　　圖 2綠球藻在不同氮磷比污水中的生物量(不同小寫字母表示不同實(shí)驗(yàn)組之間存在顯著差異(p<0.05))

　　3.2 不同氮磷比對(duì)綠球藻去除污水氨態(tài)氮的影響

　　培養(yǎng)12 d后, 各處理組的綠球藻對(duì)豬場(chǎng)污水的氨態(tài)氮去除率均較高, 達(dá)70%以上(圖 3).N:P為64:1組對(duì)氨態(tài)氮的去除率達(dá)到最高, 為74.94%, 氨態(tài)氮濃度從291.31 mg·L-1降低至73.01 mg·L-1;其次是32:1、16:1和8:1組, 去除率分別為73.71%、73.40%和71.44%, 均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).對(duì)照組對(duì)氨態(tài)氮的去除率最低(68.79%), 氨態(tài)氮濃度從291.31 mg·L-1降低至90.91 mg·L-1.

　　圖 3不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除氨態(tài)氮的影響

　　3.3 不同氮磷比對(duì)污水中硝態(tài)氮濃度的影響

　　培養(yǎng)過程中, 各處理組水體中的硝態(tài)氮濃度呈升高趨勢(shì)(圖 4).培養(yǎng)12 d后, N:P為64:1組的硝態(tài)氮濃度最高, 從13.31 mg·L-1增加至48.66 mg·L-1, 其次是32:1和16:1組, 均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).對(duì)照組硝態(tài)氮增加量最低, 從13.31 mg·L-1增加至38.21 mg·L-1.

　　圖 4不同氮磷比對(duì)污水中硝態(tài)氮濃度的影響

　　3.4 不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總氮的影響

　　由圖 5可知, 初始水體中總氮濃度為290.84 mg·L-1, 試驗(yàn)結(jié)束時(shí), N:P為64:1組的總氮去除率最高, 水體中總氮濃度降低至148.96 mg·L-1, 總氮去除率為48.8%.其次為32:1和16:1組, 且三者之間無顯著差異(p>0.05), 但均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).對(duì)照組的總氮去除率最低, 為42.71%, 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)水體中總氮濃度為166.61 mg·L-1.

　　圖 5不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總氮的影響

　　3.5 不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總磷的影響

　　不同處理組水體中總磷濃度的變化如圖 6所示, 各處理組的總磷去除率隨N:P增大而增大.總磷去除率最高的為對(duì)照組, 達(dá)到82.74%, 其次為64:1組, 去除率為71.86%.試驗(yàn)結(jié)束時(shí), N:P為64:1和對(duì)照組污水中總磷濃度分別為3.07和0.22 mg·L-1.N:P為8:1組的總磷去除率最低, 僅為33.62%.

　　圖 6不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總磷的影響

　　4 討論(Discussion)

　　氮是微藻生長(zhǎng)過程中一種重要的營(yíng)養(yǎng)素, 主要用于合成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及其他具有生理活性的含氮化合物.微藻可以利用多種形式的氮源, 但微藻生長(zhǎng)狀態(tài)與氮源的形式和數(shù)量有密切聯(lián)系.通常情況下綠藻類會(huì)優(yōu)先利用氨態(tài)氮, 直到耗盡后才開始利用硝態(tài)氮.因此, 選擇綠藻門的微藻可以較好地適應(yīng)畜禽養(yǎng)殖污水的特點(diǎn), 利用氨態(tài)氮作為其生長(zhǎng)的氮源, 從而達(dá)到凈化污水的目的.然而, 高濃度的氨氮對(duì)微藻生長(zhǎng)具有抑制作用, 微藻能夠耐受的氨態(tài)氮濃度隨著藻種的不同存在差異.本試驗(yàn)采用的綠球藻, 正是一株從豬場(chǎng)污水中篩選出的綠藻藻株, 相比天然水體中分離的微藻, 其對(duì)高氨氮污水的適應(yīng)性更強(qiáng).

　　磷是微藻合成磷脂、核酸、核苷酸等物質(zhì)的重要元素, 是微藻生長(zhǎng)必需的基本營(yíng)養(yǎng)素.微藻對(duì)磷的吸收有2種用途, 一是合成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì), 如磷脂等;另一種被稱為“奢侈消費(fèi)”(luxury uptake), 即微藻吸收過量的磷并以無機(jī)多磷酸鹽形式貯存，當(dāng)外界磷濃度受限制時(shí), 藻細(xì)胞內(nèi)貯存的磷酸鹽則可被利用.因此, 當(dāng)微藻進(jìn)入在一個(gè)相對(duì)缺磷的培養(yǎng)體系中, 微藻仍然可以利用先前貯存的磷源實(shí)現(xiàn)一定的生長(zhǎng).

　　本研究中, 在初始氨氮濃度為291.31 mg·L-1的條件下, 無論是否添加磷源, 各組污水中的綠球藻都表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)性能, 其中, N:P為64:1組在第8 d時(shí)具有最大的細(xì)胞密度, 從最初的400×104 cells·mL-1上升到3646×104 cells·mL-1, 相對(duì)生長(zhǎng)率達(dá)0.279, 12 d時(shí)生物量達(dá)0.49 g·L-1.劉林林等(2014)研究了狹形小樁藻在豬場(chǎng)污水中的生長(zhǎng)性能, 其最高相對(duì)生長(zhǎng)率為0.120.嚴(yán)佳琪等(2012)研究了5種淡水微藻在f/2培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng)性能, 其中, 綠球藻SHOU-F3的最高相對(duì)生長(zhǎng)率K為0.21.對(duì)比上述研究與本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 本研究所用綠球藻在豬場(chǎng)沼液中的相對(duì)生長(zhǎng)率較高, 表明此株綠球藻在高氨氮濃度污水中生長(zhǎng)較好, 且污水的N:P比值對(duì)耐污綠球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著影響.培養(yǎng)液中N:P影響微藻生長(zhǎng)已在多種微藻中得到證實(shí).劉皓等(2010)用不同氮磷比培養(yǎng)液培養(yǎng)中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), N:P為64:1組的生長(zhǎng)率和細(xì)胞數(shù)量最高.Rhee(1978)發(fā)現(xiàn), 柵藻(Scenedesmus sp.)在不受任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)限制的情況下, 所需N:P為30:1.Li等(2010)報(bào)道了柵藻(Scenedesmus sp.)的最適氮磷比是5:1~8:1.Kim等(2013)認(rèn)為微藻生長(zhǎng)最適的氮磷比取決于氮源種類.盡管Stumn提出藻類的“經(jīng)驗(yàn)分子式”為C106H181O45N16P, 但藻細(xì)胞組成會(huì)受藻種不同及培養(yǎng)條件等因素影響, 不同藻種代謝途徑有差異, 因此, 16:1并不是所有藻株最適的氮磷比(Arbib et al., 2013).本研究中, 綠球藻在污水中生長(zhǎng)的最適氮磷比為64:1, 也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Redfield比值(N:P=16:1).這可能與該藻株分離自豬場(chǎng)污水有關(guān).豬場(chǎng)污水中氮相對(duì)于磷顯著偏高, 推測(cè)該株綠球藻已經(jīng)適應(yīng)了在高氨氮濃度及高氮磷比條件并生長(zhǎng)存活.這也進(jìn)一步暗示通過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)馴化, 可以提升微藻適應(yīng)高氨氮濃度及高氮磷比的能力.

　　培養(yǎng)液氮磷比值不但影響綠球藻的生長(zhǎng), 還影響綠球藻對(duì)污水中氮、磷的吸收凈化效果.本研究發(fā)現(xiàn), N:P約為532:1的原污水中綠球藻生長(zhǎng)和去除氮效果最差, 添加NaH2PO4調(diào)整N:P后, 各組綠球藻的生長(zhǎng)和去除氮效果均有改善.綠球藻在N:P為64:1的污水中生長(zhǎng)最好, 且對(duì)氨態(tài)氮、總氮去除率高達(dá)74.94%和48.78%, 氨氮的濃度降至73.01 mg·L-1, 基本達(dá)到集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)水污染物最高允許日均排放濃度限定的70 mg·L-1 (浙江省環(huán)境保護(hù)局等, 2005).說明在豬場(chǎng)養(yǎng)殖污水中磷不足條件下, 綠球藻對(duì)氮的吸收受到限制, 補(bǔ)充磷源后, 綠球藻的細(xì)胞密度和對(duì)氮的去除效果明顯提高.Martineza等(2014)也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)微藻的無磷培養(yǎng)液中添加磷源后, 藻細(xì)胞內(nèi)磷濃度和培養(yǎng)液中氨態(tài)氮的去除率顯著增加.Wang和Lan(2011)發(fā)現(xiàn), 富油新綠藻(Neochloris oleoabundans)對(duì)污水中氮的去除受N:P影響顯著, 而磷的去除對(duì)N:P不敏感.Beuckels等(2015)的研究結(jié)果表明, 氮濃度對(duì)磷的去除率有積極影響, 磷的高效去除需要高濃度的氮.這為以后提高豬場(chǎng)養(yǎng)殖污水中氮的去除效率提供了有力依據(jù).

　　對(duì)照污水中綠球藻的生長(zhǎng)曲線和污水中氨態(tài)氮、總氮和硝態(tài)氮的去除曲線, 可以發(fā)現(xiàn), 在綠球藻快速生長(zhǎng)的前6 d, 污水中的氨態(tài)氮也呈快速下降的趨勢(shì), 且各組間的氨態(tài)氮去除率隨微藻的相對(duì)生長(zhǎng)率增大而增大, 表明微藻的快速生長(zhǎng)是引起污水中氮、磷濃度下降的主要原因.然而, 在此期間, 硝態(tài)氮沒有被利用, 反而濃度略升高.一方面, 可能是豬場(chǎng)養(yǎng)殖污水中存在硝化細(xì)菌, 硝化細(xì)菌將部分氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化成硝態(tài)氮所致.另一方面, 也可能是微藻快速生長(zhǎng)過程中光合作用產(chǎn)生的氧, 加速了部分氨態(tài)氮氧化成硝態(tài)氮所致.培養(yǎng)期間, 藻細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí), 氨態(tài)氮、總氮和總磷濃度下降而硝態(tài)氮濃度上升的現(xiàn)象也證明了該株綠球藻優(yōu)先利用氨態(tài)氮的特點(diǎn).

　　然而, 對(duì)照污水中綠球藻的生長(zhǎng)曲線和污水中總磷的吸收曲線, 盡管在綠球藻快速生長(zhǎng)的前6 d, 污水中的總磷也呈快速下降的趨勢(shì), 但各組總磷的去除率并不與各組綠球藻的相對(duì)生長(zhǎng)率存在正相關(guān), 初始總磷水平越低, 總磷的去除率越高.N:P為8:1組的初始磷濃度最高(87.62 mg·L-1), 前6 d對(duì)磷的去除率為30.08%, 而對(duì)照組初始磷濃度最低(1.27 mg·L-1), 前6 d的磷去除率高達(dá)82.74%, 但高磷水平組總磷的絕對(duì)去除量更高, 此結(jié)果也證明了微藻對(duì)磷的“奢侈消費(fèi)”現(xiàn)象.N:P為64:1組在綠球藻培養(yǎng)12 d時(shí)的總磷去除率達(dá)71.86%, 總磷濃度降低為3.07 mg·L-1, 低于集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)水總磷最高允許日均排放濃度限定的7 mg·L-1 (浙江省環(huán)境保護(hù)局等, 2005).然而, 通過添加磷源以提高微藻對(duì)豬場(chǎng)廢水的凈化效率會(huì)增加處理成本, 從現(xiàn)實(shí)應(yīng)用的角度, 還需考慮其經(jīng)濟(jì)性能.具體參見污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　5 結(jié)論(Conclusions)

　　污水中氮磷比值影響綠球藻生長(zhǎng)及其對(duì)污水中氮、磷的凈化效果, 在初始氨氮濃度為291.31 mg·L-1的豬場(chǎng)養(yǎng)殖污水中, 通過添加NaH2PO4以調(diào)節(jié)污水N:P為64:1, 接種綠球藻(Chlorococcum sp.)培養(yǎng)12 d后, 可使污水中的氨態(tài)氮和總磷分別降低到73.01 mg·L-1和3.07 mg·L-1, 基本達(dá)到相關(guān)排放標(biāo)準(zhǔn).