污水處理廠污水成份復(fù)雜，常含有一些難以降解的微量污染物，例如關(guān)注較多的農(nóng)藥、醫(yī)藥、個(gè)人護(hù)理品以及內(nèi)分泌干擾物等.污水處理廠出水在達(dá)到現(xiàn)行常規(guī)指標(biāo)要求時(shí)，對(duì)這些微量污染物的去除效果并不佳.因此，污水廠出水成為水環(huán)境中微量污染物的主要來(lái)源.這些微量污染物進(jìn)入水環(huán)境后會(huì)影響水生生物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)破壞.通常，人們采用一些化學(xué)分析法對(duì)水樣中的微量污染物進(jìn)行定性或者定量分析，例如高效液相色譜、氣相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜法等.但這些化學(xué)分析方法需要較高的費(fèi)用以及熟練的操作技術(shù)，并且這些微量污染物共存于水環(huán)境時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生拮抗、協(xié)同或者加和作用，故單個(gè)物質(zhì)濃度不能反映水樣的生物效應(yīng).目前，污水處理廠出水成為水環(huán)境健康的一個(gè)重要的潛在危險(xiǎn)源.例如，Sponza發(fā)現(xiàn)紙漿和造紙廠出水達(dá)到了行業(yè)的排放標(biāo)準(zhǔn)，但生物毒性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)魚(yú)類和藻類具有急性毒性.周海東等研究表明污水處理廠雖能較好地去除內(nèi)分泌干擾物，但污水廠的出水仍具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).為實(shí)現(xiàn)城市污水的資源化和無(wú)害化，有必要對(duì)污水處理前后的生物毒性進(jìn)行全面的檢測(cè)和評(píng)價(jià).多數(shù)研究采用不同類型的單一生物毒性方法對(duì)工業(yè)廢水和生活污水進(jìn)行評(píng)價(jià)，而利用成組生物實(shí)驗(yàn)并采用綜合毒性評(píng)價(jià)方法對(duì)污水毒性削減程度進(jìn)行評(píng)價(jià)的研究尚缺乏.

　　本研究利用發(fā)光菌急性毒性實(shí)驗(yàn)、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)和雌激素活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了A2/O工藝對(duì)城市生活污水毒性的去除效果，并采用水質(zhì)安全分級(jí)法對(duì)生物毒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià);同時(shí)通過(guò)雄性斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)分析了水樣對(duì)水生生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾作用的機(jī)制，以期為污水處理工藝運(yùn)行參數(shù)優(yōu)化及工藝改進(jìn)提供理論依據(jù)，進(jìn)一步保障受納水體的生態(tài)安全.

　　1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

　　苯酚(phenol)、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NOQ)、鄰硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG) 和雌二醇(E2) 購(gòu)自Sigma公司. HPLC級(jí)甲醇、乙酸乙酯購(gòu)于天津科密歐公司.

　　1.2 水樣的采集和預(yù)處理

　　從污水處理廠的細(xì)格柵、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水(加氯消毒后，如圖 1) 各采集3 L水樣于棕色玻璃容器中，并立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理.其中1 L水樣用于發(fā)光菌急性毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)，2 L水樣用于雌激素活性檢測(cè)和斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn).水樣經(jīng)玻璃纖維膜(0.8 μm, Millipore, GF/F) 過(guò)濾后進(jìn)行固相萃取.水樣中的諸如雌二醇(E2)、雌酮(E1)、雌三醇(E3) 以及雙酚A等雌激素或類雌激素屬于弱極性物質(zhì)[11]，根據(jù)相似相溶原理，針對(duì)不同的生物毒性，本研究采用不同的萃取方法，具體步驟如下.

圖 1 A2/O工藝流程及取樣點(diǎn)

　　對(duì)于發(fā)光菌急性毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)，水樣的萃取方法參照Ma等的研究，依次用14 mL甲醇、10 mL超純水活化Oasis HLB (200 mg，6 mL，Waters) 柱子;水樣以流速5~10 mL·min-1過(guò)柱，然后用10 mL超純水清洗管路，干燥30 min，離心15 min去除水份;進(jìn)樣完畢，用10 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈?最后用1% DMSO將殘留物溶解，定容至5 mL用于實(shí)驗(yàn).

　　對(duì)于雌激素活性和斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)，水樣的萃取方法參照王昌穩(wěn)等的研究，依次用10 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇和10 mL超純水對(duì)上述柱子進(jìn)行活化;水樣以流速5~10 mL·min-1過(guò)柱，然后用10 mL超純水清洗管路，干燥30 min，離心15 min去除水份;進(jìn)樣完畢，用10 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈?最后用1 mL純DMSO溶解濃縮至2 000倍，吸取其中500 μL濃縮液用于雌激素活性，剩余濃縮液稀釋至400 mL (濃縮2.5倍) 用于斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn).

　　1.3 發(fā)光菌急性毒性實(shí)驗(yàn)

　　發(fā)光菌毒性測(cè)試采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 11348急性毒性15 min暴露方法，實(shí)驗(yàn)菌種為費(fèi)氏弧菌(購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心).實(shí)驗(yàn)前將保存的菌種轉(zhuǎn)接于50 mL的液體培養(yǎng)基中，在20℃，180 r·min-1條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)，用2% NaCl稀釋菌液使其相對(duì)發(fā)光值為300~400萬(wàn)RLU;將100 μL濃縮的樣品、陽(yáng)性對(duì)照(苯酚) 以及100 μL菌液加入96孔板，在檢測(cè)儀上高速振蕩30 s，搖勻，暴露15 min后測(cè)定發(fā)光值.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，并設(shè)置板間平行.樣品的RLU平均值記為I，空白對(duì)照的RLU平均值記為I0.根據(jù)公式(1) 計(jì)算不同濃縮倍數(shù)的污水的發(fā)光抑制率E.

　　1.4 遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

　　本實(shí)驗(yàn)采用由Oda博士(日本大阪府立公共衛(wèi)生研究所) 提供的鼠傷寒沙門(mén)氏菌Salmonella typhimuriumTA1535/pSK1002菌株，具體實(shí)驗(yàn)方法參照ISO 13829將新下平板的菌株接種到LB培養(yǎng)基中，在37℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)，當(dāng)其在600 nm的吸光度為2.2±0.2時(shí)，用TGA稀釋10倍，放置搖床培養(yǎng)1.5~2 h，使菌液在600 nm的吸光度為0.75±0.5. 96孔板1板中B~H排加入1%的DMSO 180 μL，A排加入濃縮的樣品360 μL，用排槍混勻后吸出180 μL加入B排，混勻，再吸出180 μL至C排，依次至F排. G排為溶劑對(duì)照(1% DMSO)，H排為陽(yáng)性對(duì)照(4-NOQ) 和空白對(duì)照.除空白外，每孔加入70 μL菌液，37℃下振蕩培養(yǎng)2 h. 1板結(jié)束后，每孔取30 μL加至含有270 μL TGA培養(yǎng)基的96孔板2板中，37℃下振蕩培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm的吸光度.從2板每孔取30 μL加至含有120 μL B-buffer的96孔板3板中. 3板每孔加30 μL ONPG，28℃下振蕩培養(yǎng)0.5 h，最后加入120 μL Na2CO3終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定420 nm的吸光度.實(shí)驗(yàn)過(guò)程未加S9代謝活化劑.實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，并設(shè)板間平行，根據(jù)公式(2) 和公式(3) 計(jì)算結(jié)果:

　　式中, G為生長(zhǎng)因子，IR為誘導(dǎo)率;G>0.5時(shí)可用于計(jì)算IR;IR≥1.5可判斷致突變陽(yáng)性;A600, T、A600, B、A600, N、A420, T、A420, B、A420, N分別為測(cè)定樣品、空白對(duì)照和溶劑對(duì)照在600 nm、420 nm處的光密度值.

　　1.5 雌激素活性

　　雌激素活性采用中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心建立的酵母菌雌激素活性評(píng)價(jià)方法.將酵母菌置于SD培養(yǎng)基中，30℃、130 r·min-1條件下培養(yǎng)36 h.用SD培養(yǎng)液稀釋菌液，使其在600 nm的吸光度值為0.75左右，吸取995 μL菌液于1.5 mL滅菌離心管中，加入5 μL待分析的樣品混勻，每個(gè)樣品設(shè)置8個(gè)濃度.取200 μL的混合菌液到96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，30℃、800 r·min-1條件下暴露4 h.測(cè)定菌液600 nm的吸光度，隨后每孔棄去150 μL，加入120 μL測(cè)試緩沖液和20 μL氯仿，1 200 r·min-1振蕩15 min，然后加入40 μL ONPG，于30℃、800 r·min-1下培養(yǎng)，顯色60 min后，每孔加入100 μL碳酸鈉溶液，終止反應(yīng).吸取上清液200 μL至新96孔板中，測(cè)定420 nm的吸光度.同時(shí)以DMSO做溶劑對(duì)照，E2為陽(yáng)性對(duì)照. β-半乳糖苷酶活性(U) 按公式(4) 計(jì)算:

　　式中，t為加入ONPG到溶液顯色時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，60 min;V為菌液體積，0.2 mL;A600、A420分別為菌液在600 nm、420 nm處的光密度值;A′420為空白對(duì)照在420 nm的光密度值;D為稀釋因子(6.6).

　　由劑量效應(yīng)曲線得出β-半乳糖苷酶活性(U) 后，根據(jù)最小二乘法如公式(5) 計(jì)算水樣的EC50.

　　式中，y為β-半乳糖苷酶活性;X為水樣濃縮倍數(shù);A為最大β-半乳糖苷酶活性;B為回歸曲線中點(diǎn)的斜率;C為半數(shù)最大β-半乳糖苷酶活性時(shí)水樣的濃縮倍數(shù)(EC50);D為本底β-半乳糖苷酶活性.

　　1.6 水質(zhì)安全分析

　　由于水體中污染物種類繁多，每種物質(zhì)引起的毒性不同，因此選用多組生物毒性檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)更有意義. Xu等建立了基于多種生物毒性檢測(cè)的水質(zhì)安全評(píng)價(jià)方法，本文采用該方法對(duì)水樣進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體方法如下:通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)外推法進(jìn)行改進(jìn)，提出毒性的4個(gè)得分指標(biāo): 1、2、3、4;數(shù)字越大，毒性越強(qiáng).根據(jù)引起顯著毒性效應(yīng)的水樣最低濃度將毒性測(cè)試結(jié)果轉(zhuǎn)化為毒性得分，在此基礎(chǔ)上，對(duì)水樣的3種毒性得分進(jìn)行匯總，提出水質(zhì)安全分級(jí)指標(biāo)A、B、C、D，水質(zhì)安全性依次降低，由毒性測(cè)試結(jié)果中最差的得分值確定水質(zhì)的安全級(jí)別.將各生物毒性結(jié)果用當(dāng)量表示，樣品的毒性當(dāng)量與陽(yáng)性對(duì)照的可預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度(PNEC) 進(jìn)行對(duì)比，參照水質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)確定樣品的得分如表 1所示.在本研究中，陽(yáng)性對(duì)照的PNEC值基于物種敏感性分布(SSDs).

　　表 1 水質(zhì)安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)1)

　　1.7 斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)

　　將6條馴化良好的成熟雄性斑馬魚(yú)暴露于400 mL濃縮2.5倍的水樣中(污水廠進(jìn)水、二級(jí)出水以及地表水進(jìn)水) 和空白(DMSO<0.01)，并設(shè)置3個(gè)平行.每48 h更新一次溶液，暴露周期為8 d，暴露期間未喂食.在暴露終點(diǎn)時(shí)，隨機(jī)取出5條斑馬魚(yú)，并立即轉(zhuǎn)移至冰塊上麻痹，待其凍僵后，用蒸餾水清洗魚(yú)體，解剖鏡下解剖，取出肝臟和生殖腺，迅速放入預(yù)冷的TRIzol試劑中，用RNA試劑盒(Takara, Japan) 提取肝臟和生殖腺的總RNA.用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260 nm和280 nm的吸光值A(chǔ)260和A280，當(dāng)A260/A280的比值介于1.8~2.0之間時(shí)，方可用于實(shí)驗(yàn).經(jīng)反轉(zhuǎn)錄提取的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA.在GenBank上查得斑馬魚(yú)雌激素受體(esr1) 和卵黃原蛋白基因(vtg1) 的mRNA序列.實(shí)驗(yàn)選取不受環(huán)境和組織器官影響的18S rRNA作為參比引物，引物使用前用無(wú)菌ddH2O稀釋到10 μmol·L-1.定量PCR的過(guò)程參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行操作.最終結(jié)果用相對(duì)定量2-ΔΔCt計(jì)算.

　　1.8 數(shù)據(jù)處理

　　發(fā)光菌急性毒性和雌激素活性用半數(shù)效應(yīng)濃度EC50表示，而遺傳毒性用“遺傳毒性潛力值” IR1.5定量比較水樣的遺傳毒性大小.為了便于不同樣品間進(jìn)行比較，將所有樣品的毒性折算成具有相同效應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照的濃度，其中發(fā)光菌毒性和遺傳毒性當(dāng)量分別用TEQphenol、TEQ4-NOQ表示，雌激素活性用EEQE2表示，即TEQphenol=EC50-phenol/EC50-樣品、TEQ4-NOQ=IR1.5-4-NOQ/EC50-樣品、EEQE2=EC50-E2/EC50-樣品.斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad®Prism5軟件進(jìn)行作圖.利用Newman-Keuls方法進(jìn)行處理組和對(duì)照組之間的差異性分析，P≤0.05表示具有顯著性差異.

　　2 結(jié)果與討論 2.1 發(fā)光菌急性毒性

　　水樣對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光抑制的劑量-效應(yīng)曲線如圖 2所示.在本實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照苯酚的EC50為2.82 mmol·L-1，與袁星等[19]研究結(jié)果相接近(2.35 mmol·L-1)，驗(yàn)證了該方法的可靠性.各樣品毒性采用濃縮倍數(shù)N表示，當(dāng)抑制率為50%時(shí)，進(jìn)水、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的濃縮倍數(shù)N分別為1.44、0.94、1.86、12.67、12.79、24.70.將樣品毒性結(jié)果用TEQphenol表示，以上樣品的TEQphenol分別為184.97、283.36、143.59、21.03、20.83、10.78 mg·L-1.毒性由大到小依次為:曝氣沉砂池>進(jìn)水>初沉池>好氧池>二沉池>出水.本實(shí)驗(yàn)中曝氣沉砂池的毒性大于進(jìn)水毒性，這可能是由于一些物質(zhì)以共軛的形式存在于環(huán)境中，而經(jīng)過(guò)曝氣沉砂池時(shí)變成非共軛形式或者被激活而表現(xiàn)出毒性，最終出現(xiàn)曝氣沉砂池的急性毒性增加的現(xiàn)象.總體而言，隨著工藝流程的進(jìn)行，發(fā)光菌急性毒性降低.尤其是經(jīng)過(guò)好氧池后，發(fā)光菌急性毒性降低92.58%.由此可以得出二級(jí)生物處理能大幅度降低污水的急性毒性.經(jīng)過(guò)加氯消毒后，出水的毒性降低48.24%.王麗莎等[9]利用發(fā)光菌毒性測(cè)試對(duì)某污水廠再生水處理工藝進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)進(jìn)水發(fā)光菌發(fā)光抑制率為63%，二沉池出水為0%，加氯消毒后提高到93%，說(shuō)明加氯消毒能增大出水毒性.塔春紅等研究表明在正常濃度水平下的無(wú)機(jī)副產(chǎn)物(ClO2-和ClO3-) 均不表現(xiàn)出急性毒性，消毒后生物毒性的增加主要由消毒副產(chǎn)物引起.而投氯量是影響消毒副產(chǎn)物產(chǎn)生的一個(gè)重要因素.該處理工藝可能存在氯投加量過(guò)多的現(xiàn)象，導(dǎo)致有些消毒副產(chǎn)物同余氯發(fā)生反應(yīng)或者降解，消毒副產(chǎn)物生成量增加后出現(xiàn)減小的趨勢(shì)，造成急性毒性降低.

　　2.2 遺傳毒性

　　本實(shí)驗(yàn)以4-NOQ為陽(yáng)性對(duì)照，其IR1.5-4-NOQ的值為19.58 μg·L-1.當(dāng)4-NOQ的濃度為50 μg·L-1，IR的值為3.38，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO13829具有可比性，說(shuō)明該方法的可行性.水樣的遺傳毒性的劑量-效應(yīng)曲線如圖 3所示，當(dāng)IR=1.5時(shí)，進(jìn)水、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的濃縮倍數(shù)N分別為1.15、0.92、1.89、43.79、48.64、111.50.將上述樣品的遺傳毒性用TEQ4-NOQ表示，分別為17.02、21.28、10.36、0.447、0.403、0.17 μg·L-1.遺傳毒性的順序依次為:曝氣沉砂池>進(jìn)水>初沉池>好氧池>二沉池>出水.在本實(shí)驗(yàn)中，曝氣沉砂池的遺傳毒性大于進(jìn)水，這可能是由于曝氣沉砂池的曝氣和水流的螺旋旋轉(zhuǎn)作用，使污水中懸浮顆粒相互碰撞、摩擦，并受到氣泡上升的沖刷作用，導(dǎo)致砂粒上附著的有機(jī)成分被剝離而溶于水中引起.除曝氣沉砂池以外，隨著工藝流程進(jìn)行遺傳毒性降低.其中，好氧池對(duì)遺傳毒性的去除率高達(dá)95.68%，因此二級(jí)處理工藝能夠顯著地降低遺傳毒性.加氯消毒后，污水出水的遺傳毒性降低57.82%，該結(jié)果和污水對(duì)發(fā)光菌的熒光抑制毒性具有一致性.造成加氯消毒后遺傳毒性降低的原因如發(fā)光菌急性毒性所述，投氯量較多時(shí)，消毒副產(chǎn)物被分解.

圖 3 水樣的遺傳毒性的劑量-效應(yīng)曲線

　　2.3 雌激素活性

　　本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照E2的EC50為15.05 ng·L-1，與Beck等[26]研究相比(EC50=48.96 ng·L-1)，該方法的靈敏度較高，適用于廣范圍的水樣類型.水樣的β-半乳糖苷酶活性的劑量-效應(yīng)關(guān)系如圖 4所示.水樣的雌激素活性用濃縮倍數(shù)N表示時(shí)，進(jìn)水、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的EC50分別為2.07、2.02、2.45、7.57、8.29、7.89.將上述樣品用EEQE2表示時(shí)，其EEQE2分別為7.29、7.45、6.15、1.98、1.82、1.89 ng·L-1.與急性毒性、遺傳毒性類似，曝氣沉砂池的雌激素活性最強(qiáng).人體的尿液中，雌激素以共軛的形式存在，通過(guò)物質(zhì)之間的化學(xué)作用或者微生物酶的作用，曝氣沉砂池中的雌激素以自由態(tài)的形式被釋放，這可能導(dǎo)致雌激素活性增加.整體而言，雌激素活性也隨著流程的進(jìn)行逐漸降低.其中，好氧池對(duì)雌激素活性的去除率高達(dá)72.84%.這種去除效果可能是由于微生物的降解和污泥的吸附作用.尤其是A2/O工藝具有延長(zhǎng)生物處理的特點(diǎn)，在脫氮除磷過(guò)程中，氨氧化菌可將雌激素物質(zhì)硝化，進(jìn)而產(chǎn)生雌激素活性較低的產(chǎn)物，如E1和E2的硝化產(chǎn)物的活性低于母體本身.而加氯消毒沒(méi)有降低出水的雌激素活性，這可能是由于在消毒過(guò)程中產(chǎn)生的消毒副產(chǎn)物具有雌激素活性, 從而導(dǎo)致出水的雌激素活性比較恒定的現(xiàn)象，例如E1、E2和EE2的消毒副產(chǎn)物具有與母體相當(dāng)?shù)拇萍に鼗钚?

圖 4 水樣雌激素活性的劑量-效應(yīng)曲線

　　Jarošová等指出當(dāng)水環(huán)境的EEQE2高于1 ng·L-1會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生一定的危害. Vethaak等[32]曾報(bào)道河流的EEQE2為0.17 ng·L-1時(shí)，可導(dǎo)致雄魚(yú)體內(nèi)卵黃原蛋白顯著性上升.本實(shí)驗(yàn)污水的出水的EEQE2為1.89 ng·L-1, 故其有可能對(duì)受納水體的水生生物產(chǎn)生潛在的危害.

　　2.4 水質(zhì)安全評(píng)價(jià)

　　在3種體外生物毒性測(cè)試的基礎(chǔ)上，通過(guò)SSD法計(jì)算得出PNECphenol為2.94 mg·L-1，參照Xu等得出的PNEC4-NOQ(0.64 μg·L-1) 和PNECE2(2 ng·L-1) 值，結(jié)合水質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)評(píng)價(jià)方法，對(duì)各流程出水進(jìn)行了水質(zhì)安全評(píng)價(jià)研究，結(jié)果如圖 5所示.進(jìn)水的生物毒性得分最高，其中急性毒性和遺傳毒性得分為3，雌激素活性得分為2[圖 5(a)]，水質(zhì)安全級(jí)別為C級(jí)，屬于較差的水質(zhì).經(jīng)曝氣沉砂池和初沉池處理后，污水水質(zhì)安全級(jí)別并沒(méi)有提高[圖 5(a)].經(jīng)過(guò)好氧池處理之后，發(fā)光菌毒性得分為2，遺傳毒性和雌激素活性得分為1，水質(zhì)級(jí)別提高到B級(jí)[圖 5(b)]，經(jīng)二沉池和加氯消毒處理之后，出水水質(zhì)安全性沒(méi)有得到進(jìn)一步改善，水質(zhì)級(jí)別仍為B級(jí)[圖 5(b)].顯然污水的雌激素活性對(duì)水質(zhì)安全性影響最小，而發(fā)光菌急性毒性對(duì)其影響最大.由此可知，根據(jù)污染物具有的主要生物毒性效應(yīng)而采取針對(duì)性的處理工藝更有利于水質(zhì)達(dá)到安全性級(jí)別.本實(shí)驗(yàn)中，雖然生物毒性都得到降低，但污水的急性毒性效應(yīng)未使出水水質(zhì)達(dá)到安全性級(jí)別，可能會(huì)對(duì)周圍的生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生潛在的生態(tài)危害.

圖 5 污水各處理工藝出水的安全性級(jí)別

　　2.5 斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)

　　綜上所述，污水出水仍會(huì)對(duì)受納水體的水生生物帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn).本研究進(jìn)一步通過(guò)雄性斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)了解水樣對(duì)水生生物的毒性機(jī)制.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中斑馬魚(yú)未出現(xiàn)死亡.雄性斑馬魚(yú)的肝臟和生殖腺內(nèi)的esr1基因和vtg1基因表達(dá)如圖 6所示.污水廠進(jìn)水、二級(jí)出水以及地表水進(jìn)水濃縮2.5倍后，導(dǎo)致雄性斑馬魚(yú)肝臟和生殖腺的vtg1表達(dá)上升[圖 6(a)和6(c)]. vtg1的誘導(dǎo)是卵生脊椎動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)雌激素效應(yīng)的一個(gè)標(biāo)志.因此本實(shí)驗(yàn)表明了水樣對(duì)雄性斑馬魚(yú)產(chǎn)生雌激素效應(yīng).研究過(guò)程中，通過(guò)化學(xué)分析檢測(cè)到水樣中的主要雌激素為E2和乙炔雌二醇(EE2)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)，地表水進(jìn)水中的E2和EE2濃度接近EC50(導(dǎo)致斑馬魚(yú)體內(nèi)卵黃原蛋白基因表達(dá)量達(dá)到最大值一半時(shí)的濃度). Thorpe等指出將斑馬魚(yú)暴露在濃度為1 ng·L-1的EE2和E2時(shí)，可觀察到卵黃原蛋白的生成.因此，本實(shí)驗(yàn)中雄性斑馬魚(yú)體內(nèi)vtg1的增加是持續(xù)暴露在水樣中的必然結(jié)果.

圖 6 暴露在進(jìn)水、二級(jí)出水和地表水進(jìn)水中的雄性斑馬魚(yú)生殖腺和肝臟的目的基因(esr1和vtg1) 的變化

　　生殖腺中的esr1的表達(dá)受到抑制[圖 6(b)]，說(shuō)明水樣對(duì)雄性斑馬魚(yú)具有抗雌激素效應(yīng).該結(jié)果和酵母菌體外檢測(cè)相反，這可能由以下兩方面原因引起:首先，水樣成份復(fù)雜存在抗雌激素物質(zhì)，如4-n壬基酚具有一定的抗雌激素作用;其次，生物體具有代謝能力，一些物質(zhì)體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可能比母體化合物具有更強(qiáng)的生物毒性，例如防曬劑二苯甲酮-3作為二苯甲酮-4的代謝產(chǎn)物具有更強(qiáng)的抗雌激素作用而較弱的雌激素作用.而酵母菌缺乏一定的代謝能力，可能會(huì)產(chǎn)生和體內(nèi)檢測(cè)不一樣的結(jié)果.研究還發(fā)現(xiàn)雄性斑馬魚(yú)肝臟內(nèi)的esr1有微弱的表達(dá)[圖 6(d)]，這個(gè)結(jié)果和vtg1的上升以及酵母菌檢測(cè)具有一致性，進(jìn)一步說(shuō)明了水樣的雌激素效應(yīng). esr1表達(dá)水平的變化說(shuō)明了同一個(gè)基因在不同的組織器官的表達(dá)可能具有差異性.因此，在毒性效應(yīng)分析時(shí)應(yīng)從多個(gè)基因水平和多個(gè)組織或器官考慮，以獲得比較全面的信息.總之，體內(nèi)檢測(cè)揭示了水樣對(duì)斑馬魚(yú)的內(nèi)分泌干擾作用可通過(guò)干擾相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)完成.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1) 初級(jí)處理對(duì)污水的急性毒性、遺傳毒性和雌激素活性的去除效果微弱，而二級(jí)生物處理對(duì)污水的生物毒性效應(yīng)具有顯著的削減作用.

　　(2) 城市生活污水原水的水質(zhì)安全性較差，其中發(fā)光菌急性毒性對(duì)水質(zhì)安全性的影響較大，經(jīng)A2/O工藝處理之后，出水水質(zhì)安全性得到提高，但污水出水的雌激素活性水平仍會(huì)對(duì)受納水體的水生生物產(chǎn)生潛在的危害.

　　(3) 污水可通過(guò)干擾目的基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控水生生物的內(nèi)分泌且調(diào)控方式與組織器官相關(guān).