蜜餞生產在腌漬漂洗過程中產生大量廢水，具有高鹽度（3%~5%）、高COD（6000~20000mg/L）、高C/N值、水質呈酸性（pH=2.5~4.0）的特點。若未經有效處理而排放，不僅污染水體、危害水生生物，甚至可能破壞當地生態(tài)系統(tǒng)。與物化處理方法相比，生物處理方法具有成本低、處理水量大、處理效果好、易于實施等優(yōu)點，因此在實際工程中生物法是蜜餞廢水處理的首選方法，但多數蜜餞廢水處理工藝需要將廢水pH調節(jié)至中性，藥劑成本高，而且可能會引入其他污染物。
在生物處理過程中，高鹽度會增加水的密度，從而影響活性污泥沉降性能，同時破壞微生物細胞內外滲透壓平衡，降低酶活性，甚至引起微生物脫水和死亡。如果通過加水稀釋降低廢水鹽度，會導致處理水量成倍增加，池容相應增大，處理成本顯著提高。此外，較低的pH會降低微生物豐度，抑制生化反應。調節(jié)pH需要消耗大量藥劑，而多種蜜餞廢水（如金桔、李子、楊梅廢水）在pH升高后會產生凝膠狀物質而導致廢水黏稠，為后續(xù)混凝處理及曝氣充氧帶來困難。蜜餞廢水的酸性pH由酸性有機物（如果酸和檸檬酸）、無機酸（如焦亞硫酸鈉）共同作用形成，酸性有機物的降解可以實現廢水pH的提升和COD濃度的降低。鑒于此，筆者提出投加耐鹽耐酸菌劑，以期在不加堿、不稀釋情況下實現高鹽酸性廢水的高效處理，目前關于此種方法在酸性高鹽廢水處理中的應用鮮有報道。該研究采用序批式生物膜反應器（SBBR），在鹽度分別為3.5%和5.0%，進水初始pH分別為2.6、3.3和4.0的條件下接種Candida菌劑，掛膜完成后考察污染物去除性能和微生物群落結構變化。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
采用4個SBBR在不同鹽度和初始pH下開展實驗，具體如下：R1（pH=4.0，鹽度=5.0%）、R2（pH=2.6，鹽度=3.5%）、R3（pH=3.3，鹽度=3.5%）、R4（pH=4.0，鹽度=3.5%）。SBBR反應器為圓柱形，直徑為10cm，高度為30cm，有效容積為2L；底部設有曝氣頭，曝氣頭上部放置邊長為1.5cm的立方體聚氨酯填料，填料體積約占反應器有效容積的30%。SBBR運行周期為48h，包括進水0.25h、曝氣47.5h、沉降0.25h、排水。進水階段從反應器頂部緩慢加入1.5L新鮮蜜餞廢水，處理過程中DO濃度保持在5mg/L以上。
1.2 廢水來源和Candida接種液
蜜餞廢水取自廣東省揭陽市某李子加工廠的污水儲備池，其COD、TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TP均值分別為（12000±2000）、（211±28）、（138±21）、（71±18）、0、（20±5）mg/L，鹽度為3%~5%（以NaCl計的鹽度為30~50g/L），pH在2.6~4.0之間波動（以3.3居多）。不同批次廢水水質變化較大，現場調節(jié)池內的鹽度一般控制在3.5%以下。因此該研究在3.5%鹽度下考察不同pH的影響，同時研究5.0%鹽度條件下反應器的運行效果。將原廢水作為R1進水，調節(jié)pH至4.0，保持5.0%的鹽度，記作進水1；將原廢水稀釋到70%左右使鹽度降至3.5%，記作進水2，然后調節(jié)pH分別為2.6、3.3和4.0左右，分別作為R2、R3、R4的進水。調節(jié)pH所用試劑為H2SO4和NaOH溶液。
該研究使用的酵母菌Candida篩自某蜜餞廢水處理廠的調節(jié)池，其在酸性高鹽條件下具有較強的存活能力和較高的生長速率。將Candida的發(fā)酵液接種至SBBR，室溫條件下運行一周完成掛膜，肉眼可見聚氨酯填料表面布滿白色菌體。
1.3 DNA提取和擴增子測序
在每個實驗階段結束后，取40mL水樣及若干填料，振蕩搖晃使填料上的污泥脫落，離心收集污泥樣品�？�DNA采用OMEGA試劑盒E.Z.N.A.®SoilDNAKit進行提取。細菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)采用引物338F和806R進行擴增，真菌ITS1區(qū)采用引物ITS1F和ITS2R進行擴增。
聚合酶鏈式反應（PCR）擴增參數如下：在95℃預變性3min，在95℃變性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸30s，重復27個循環(huán)，最后在72℃穩(wěn)定延伸10min，于4℃下保存。樣品委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在IlluminaPE300平臺進行測序。
1.4 水質分析方法
每隔2d從SBBR的進出水取樣10mL，經0.22µm醋酸纖維濾膜過濾。COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TP均采用國家標準方法測定；總無機氮（TIN）為NH4+-N、NO2--N、NO3--N之和；DO采用溶氧儀測定；pH采用pH計測定；鹽度采用便攜式電導率儀測定。
2、結果與討論
2.1 SBBR對蜜餞廢水的處理效果
4個SBBR反應器處理蜜餞廢水過程中pH的動態(tài)變化見圖1。反應器R1~R4的ΔpH（出水pH與進水pH之差）分別為1.91±0.24、0.17±0.19、0.56±0.39、2.20±0.21；初始pH越高，出水pH提升越大；當初始pH=4.0時，出水pH穩(wěn)定在6.0左右，并且鹽度提升對出水pH的影響較小。這表明生物強化后的反應器能夠抵抗酸性環(huán)境的影響，在3.5%~5%的鹽度下實現了穩(wěn)定的pH提升，這有利于減少藥劑投加量，降低運行成本。未加入硫酸時，pH的迅速升高可能是因為酸性有機物被降解而自然提升，然而加入硫酸使初始pH<4.0時，出水pH提升不明顯，無法升至近中性，這可能是因為微生物降解無法消耗硫酸，強酸環(huán)境也影響微生物的活性，致使pH上升較慢。
4個SBBR反應器對蜜餞廢水中COD、TIN和TP的去除效果見圖2。由圖2（a）可知，在3.5%的鹽度下，反應器R2、R3、R4運行6d后對COD的去除率分別升至50.1%、61.1%、83.2%，運行10d后趨于穩(wěn)定，pH變化對COD去除效果的影響較大。圖2（b）顯示，TIN的去除率變化趨勢與COD基本一致。圖2（c）顯示，TP的去除率變化趨勢與COD和TIN略有不同，呈現先升高后降低的趨勢，10d后保持相對穩(wěn)定。綜上所述，在3.5%的鹽度下，反應器運行10d后可以實現穩(wěn)定運行，進水pH越高，反應器的處理效能越好。低pH抑制了反應器對COD、TIN和TP的去除能力，此時菌株酶活性和生物膜結構完整性下降，這是導致污染物去除率降低的重要因素。當pH=4.0時，對比R1（pH=4.0，鹽度=5.0%）和R4（pH=4.0，鹽度=3.5%）可以發(fā)現，兩個反應器達到穩(wěn)定狀態(tài)所需時間幾乎一致，但R1前期對COD、TIN、TP的去除率較低，啟動速度更慢，各項指標的去除率均低于R4�？紤]到R1的有機負荷較高，實際去除的有機物量要高于R4，因此在pH=4.0的情況下，經生物強化后的反應器可以耐受5.0%的鹽度并發(fā)揮良好的處理效能。
綜上，在初始pH為2.6~4.0、鹽度為3.5%~5.0%的條件下，各反應器的啟動時間均在10d左右，能夠快速啟動并提升pH，污染物去除率隨著pH的升高而升高，隨著鹽度的升高而降低。該研究結果證實了在高鹽低pH條件下采用Candida進行生物強化，無需對廢水進行稀釋也可以實現碳、氮、磷的高效去除，同時實現pH的提升。在實際處理中，廢水的設計停留時間一般大于2d，因此可以達到更高的污染物去除率；另外，先去除大量有機物后再投加片堿，可以緩解廢水發(fā)黏的情況，有利于減少曝氣量和污泥量，從而降低廢水處理成本。
2.2 pH對微生物豐富度和多樣性的影響
為獲取SBBR系統(tǒng)中的微生物群落信息，采用IlluminaMiSeq測序平臺對生物膜樣品進行分析。R1、R2、R3、R4和RS（原廢水）樣本的微生物有效序列分別被分類為128、356、156、187和970個操作分類單位（ASVs），如表1所示。Ace和Chao指數可以指示微生物群落的豐富度，Shannon和Simpson指數可以指示微生物群落的多樣性。
除原廢水樣本RS外，其余樣本序列的覆蓋率均大于0.99，表明所獲得的序列足以覆蓋大多數微生物菌屬。RS細菌群落的Chao指數為1125.67，R1~R4分別降為140.00、383.16、148.54、185.08；RS真菌群落的Chao指數為22.20，R1~R4分別降為18.50、12.00、21.00、21.00。結果表明，pH最低時細菌豐富度最高，真菌豐富度最低，隨著pH升高，細菌豐富度先降低后升高，真菌豐富度逐漸升高。同時，不同SBBR中細菌的Chao指數均高于真菌，說明細菌的豐富度高于真菌。細菌群落的Shannon指數在R1~R4中從初始的4.57分別降至2.59、3.00、2.73、2.99。真菌群落的Shannon指數在R1~R4中從初始的1.37分別變?yōu)?/span>1.17、0.18、1.63、2.01。這說明，原廢水中的大部分細菌和真菌不適應高鹽強酸環(huán)境，在處理過程中大部分被淘汰。
基于維恩圖分析了鹽度為3.5%時不同SBBR中ASVs水平的微生物差異和相似性，結果如圖3所示。不同SBBR中共有的細菌ASVs（2個）所屬為Oceanobacillus、Acidovorax，共有的真菌ASVs（3個）所屬為Candida、Kazachstania。原廢水中細菌和真菌的特有ASVs數目分別為853和14。在R2、R3和R4反應器中，獨特細菌ASVs數目分別為288、73、118；獨特真菌ASVs數目分別為2、5、9。這說明不同SBBR中形成了獨特的微生物群落結構。
2.3 pH對微生物群落組成的影響
微生物群落在門水平上的分布與組成見圖4。在門水平上，SBBR中細菌主要包括Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidota，真菌主要包括Ascomycota和Basidiomycota。Proteobacteria最常出現在高濃度工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中，Proteobacteria的優(yōu)勢地位可以使得系統(tǒng)對氨氮保持高效且穩(wěn)定的去除效果。Bacteroidetes被認為是海洋環(huán)境中最豐富的異養(yǎng)細菌之一，在有機物的降解中起著關鍵作用，而在該研究中Bacteroidota不能適應pH圖5為綱水平微生物群落結構。R2、R3、R4中的主要優(yōu)勢細菌分別為Gammaproteobacteria、Bacilli、Alphaproteobacteria。在R2、R3、R4中，Bacilli的相對豐度分別為8.79%、52.76%和0.52%，這表明Bacilli在酸性環(huán)境下富集，同時適應的pH范圍較小，僅在pH為3.3時占優(yōu)勢。在R2、R3、R4中，作為各反應器中最豐富的變形菌門中的兩個綱，Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria呈現不同的變化趨勢，隨著pH的增加，Gammaproteobacteria的相對豐度逐漸降低，而Alphaproteobacteria的相對豐度則先降低后升高。Alphaproteobacteria是一種需氧或兼性細菌，包含能夠降解有機物的異養(yǎng)菌和化能自養(yǎng)菌，通常在廢水處理的生物膜中占據主導地位，其與Gammaproteobacteria在高鹽條件下共同參與有機物氧化和氮轉化過程。但該研究發(fā)現，當pH降低，而Microbotryomycetes的相對豐度逐漸升高，群落結構的多樣性有助于微生物形成復雜的共生關系。
進一步使用Circos圖對屬水平上的微生物群落組成進行描述，結果見圖6。不同進水pH的3組SBBR中細菌群落結構均發(fā)生了明顯變化，原廢水中大部分細菌被淘汰。R2中的優(yōu)勢屬為Acidovorax，占比達到46.90%，Acidovorax可參與廢水中復雜有機物的降解，同時具有高效的脫氮除磷能力，在中性條件下使用材料固定化后，可以提高對污染物的降解效率。R3中的優(yōu)勢屬為Oceanobacillus，占比為45.98%，該菌在高鹽條件下具有降解復雜有機物的能力。R4中的優(yōu)勢屬為Pseudooceanicola，占比達到了29.05%，Pseudooceanicola可以提高微生物對氮和磷的去除率，加速抗生素和重金屬的去除。3組反應器中的優(yōu)勢細菌各不相同，并且在其他反應器中幾乎檢測不到，這說明不同pH構建了差異顯著的細菌生態(tài)結構，這種差異可能會影響對廢水的處理效果。
3組SBBR的真菌群落結構也發(fā)生了明顯變化，原廢水中的Kazachstania和Zygosaccharomyces在3組反應器中幾乎檢測不到。R2中的優(yōu)勢屬為Zygoascus，在R2、R3、R4中的占比分別為96.42%、23.46%和3.82%；R3和R4的優(yōu)勢屬均為Candida，在R2、R3、R4中的占比分別為0.12%、65.40%和52.74%。這說明當pH為2.6時，Zygoascus更能占據主要生態(tài)位，而投加的Candida則更適應pH≥3.3的酸性廢水環(huán)境。此外，真菌種類隨著pH的升高而升高，這說明酸性抑制了微生物多樣性，當pH提升至4.0時，真菌多樣性最高，同時污染物降解率達到最高。Zygoascus可以耐受較低pH和6.0%以下的鹽度，但常規(guī)污水處理一般在中性條件下，因此在污水處理中的相關報道較少。研究人員已證明，Candida與活性污泥系統(tǒng)進行耦合可以實現碳、氮、磷的同時高效去除，接種至UASB反應器中可以處理高濃度有機廢水，但在酸性高鹽廢水中的應用則鮮有報道。在之前報道的酵母菌生物強化處理高鹽廢水研究中，Meyerozyma作為酵母菌添加菌獲得了較好的強化處理效果，但在本研究只出現在R4中，占比為15.86%，這表明Candida更能適應酸性高鹽環(huán)境，能在蜜餞廢水處理中成為優(yōu)勢菌株并發(fā)揮良好作用。
2.4 鹽度提高對微生物群落的影響
相較于pH改變造成的微生物群落結構差異，鹽度提升對微生物群落結構的影響較小。由表1可知，當進水pH維持在4.0，鹽度從R4的3.5%升至R1的5.0%時，物種豐富度和多樣性都有所下降。
R1與R4共有細菌ASVs為46個，共有真菌ASVs為10個�；�Heatmap圖對屬水平上細菌和真菌群落結構進行描述，結果見圖7。
從圖7可以看出，即使鹽度從3.5%升至5%，Pseudooceanicola（29.1%~38.8%）、Martelella（16.7%~12.7%）、Zunongwangia（10.7%~12.5%）在反應器中仍然是優(yōu)勢菌屬，鹽度升高沒有影響主要優(yōu)勢菌屬的顯著變化。Martelella是耐鹽菌株，Wang等在3%鹽度下將Martelellasp.AD-3加入活性污泥中進行生物強化，獲得了優(yōu)異的多環(huán)芳烴降解性能。但在該實驗中，Martelella在鹽度提升后相對豐度下降，這可能是營養(yǎng)競爭的緣故。鹽度提升后，R1中Pseudooceanicola、Shewanella、Oceanobacillus、Celeribacter的相對豐度提升，表明這些菌株有較強的耐鹽性。此外，在R1和R4中，用于生物強化的Candida均占據優(yōu)勢地位，且提高鹽度后Candida的相對豐度顯著增加，由52.7%升至93.0%，這表明Candida可耐受5.0%鹽度并保持較高處理效率。
2.5 微生物群落與環(huán)境因子的相關性分析
如圖8所示，為了探究環(huán)境因子對微生物群落的影響，在微生物的屬水平上評價進水pH、鹽度、COD、TN與細菌微生物群落的相關性，通過方差膨脹因子（VIF）分析，篩選去除共線性較強（VIF>5）的環(huán)境因子，最終只保留pH和鹽度作為重要環(huán)境變量，用于后續(xù)的典范對應性分析（CCA）。pH（r2=0.9342，p=0.009）及鹽度（r2=0.8834，p=0.05）與細菌群落結構具有顯著相關性。此外，pH（r2=0.8594，p=0.009）與真菌群落結構具有顯著相關性，而鹽度（r2=0.5765，p=0.141）與真菌群落結構相關性較小。綜上，在蜜餞廢水處理中，pH與鹽度共同決定了反應器的微生物群落結構，但鹽度對真菌群落結構影響較小。
在細菌群落中，R2的優(yōu)勢屬Acidovorax以及R3的優(yōu)勢屬Oceanobacillus、Vibrio與pH和鹽度呈負相關，R1與R4的優(yōu)勢屬Pseudooceanicola與pH和鹽度呈正相關。在真菌群落中，R2的優(yōu)勢屬Zygoascus與pH和鹽度呈負相關，而用于生物強化的Candida是R1、R3、R4的優(yōu)勢屬，與pH和鹽度呈正相關。以上結果表明，Candida具有良好的抗沖擊能力，能夠在酸性高鹽條件下良好生長，這對于提高生物系統(tǒng)的處理效率和運行穩(wěn)定性至關重要。
2.6 相關性網絡分析
利用物種相關性網絡圖，揭示酸性高鹽條件下主要微生物之間的共存情況及其相關性和變化規(guī)律，結果如圖9所示。生物相互作用是物種共生模式的主要驅動因素，在生物強化過程中，145個細菌屬之間和49個細菌屬之間分別呈現顯著的正相關和負相關；28個真菌屬之間和2個真菌屬之間分別呈現顯著負相關和正相關。這些結果表明，在生物強化過程中，大多數細菌屬之間呈正相關，大多數真菌屬之間呈負相關。共生、互惠是正相關關系，而捕食、競爭等是負相關關系，通過微生物的復雜相互作用，可以實現對污染物的去除。
樞紐節(jié)點的類型和數量可以部分反映微生物群落結構在特定環(huán)境中的穩(wěn)定性。在生物強化過程中，Oceanobacillus（細菌）與18個節(jié)點相連接，其中4個節(jié)點存在負相關關系，14個節(jié)點存在正相關關系，這表明該節(jié)點在細菌網絡中最為重要，相互關系最為強烈。Rhodotorula（真菌）與5個節(jié)點相連，表明該節(jié)點在真菌網絡中的相互關系最為強烈。另外，用于生物強化的Candida的節(jié)點連接度為1，與Kazachstania呈現負相關關系。研究表明，微生物可以通過協(xié)同作用或拮抗作用來適應環(huán)境，并可能通過自身的代謝活動來去除污染物。此外，用于生物強化的Candida豐度最高，卻不是網絡中的高相關節(jié)點，其他大部分高相關節(jié)點也沒有出現在微生物群落的優(yōu)勢菌屬中，這與之前的研究一致。這表明Candida與本土菌群還沒有產生較強的合作競爭關系，因此填料的投加是有必要的，這有利于Candida保持優(yōu)勢地位以發(fā)揮作用。
3、結論
①投加Candida菌劑對SBBR進行生物強化，當處理鹽度為5.0%、初始pH為4.0的蜜餞廢水時，僅需10d即可實現高效、穩(wěn)定處理，反應后pH可以提升至6.0，2d后COD去除率可達到73.4%。
②當鹽度為3.5%時，改變初始pH對反應器處理效能產生顯著影響。運行10d后，R3（pH=3.3）和R4（pH=4.0）的各項污染物去除效果趨于穩(wěn)定，COD去除率分別為64.6%～68.7%、76.7%～79.6%，而R2（pH=2.6）的處理效果則略有波動，COD去除率為55.1%～64.6%，初始pH較高有利于提高污染物去除效率和出水pH。
③基因測序結果表明，在酸性高鹽條件下，投加的Candida菌劑表現出較強的耐受性和優(yōu)勢地位。在不同pH條件下微生物群落結構會發(fā)生顯著變化。R1（pH=4.0，鹽度=5.0%）和R4（pH=4.0，鹽度=3.5%）優(yōu)勢屬均為Pseudooceanicola和Candida，R2（pH=2.6，鹽度=3.5%）的優(yōu)勢屬為Acidovorax和Zygoascus，R3（pH=3.3，鹽度=3.5%）的優(yōu)勢屬為Oceanobacillus、Vibrio和Candida。
④相關性網絡分析揭示了微生物相互作用的復雜性，細菌主要呈現共生、互惠關系，真菌則主要呈現捕食、競爭關系。在生物強化過程中的細菌網絡中，Oceanobacillus表現為最重要的樞紐節(jié)點，而在真菌網絡中Rhodotorula則是最重要的樞紐節(jié)點。（來源：福州大學先進制造學院，自然資源部第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室）
