由于大量工業(yè)廢水的排放、農(nóng)業(yè)的長期過度使用化肥,導(dǎo)致環(huán)境水體中氨氮污染嚴(yán)重。而氮是引起富營養(yǎng)化的主要物質(zhì)。

　　膜曝氣生物反應(yīng)器(membrane aerated bioreactor, MABR)工藝具有曝氣量少、硝化與反硝化一體化、污泥發(fā)生量小以及運(yùn)行管理方便等特點(diǎn),是傳統(tǒng)工藝處理高需氧量廢水的一個(gè)引人注目的替代工藝,因此受到了世界各國水處理工作者的關(guān)注。由于在MABR 生物膜中存在明顯的分層現(xiàn)象,從而可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)硝化反應(yīng)、反硝化反應(yīng)和異養(yǎng)氧化反應(yīng) 。

　　20 世紀(jì)80 年代,研究人員發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化菌,如副球菌pantotropha sp. ,糞產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞菌等。之后越來越多的研究人員研究并篩選了好氧反硝化菌株 ,在有氧條件下好氧反硝化菌株可以去除氮。

　　本實(shí)驗(yàn)篩選高效脫氮菌,并將其應(yīng)用于膜曝氣生物反應(yīng)器中進(jìn)行強(qiáng)化研究,從而增強(qiáng)對廢水處理的效果,并利用此類反應(yīng)器處理含氮廢水,從而使反應(yīng)器具有高效、低耗的優(yōu)點(diǎn)。

　　1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

　　1. 1 好氧反硝化菌篩菌

　　1. 1. 1 菌種來源

　　菌種來源取自西安市第四污水處理廠A2 / O 中曝氣池中活性污泥。

　　1. 1. 2 培養(yǎng)基

　　培養(yǎng)基選取參考文獻(xiàn)。

　　1)富集培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基由牛肉膏1. 0 g·L - 1 ,蛋白胨5. 0 g·L - 1 和硝酸鉀1. 0 g·L - 1 組成。

　　2)選擇性培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基由Na2 HPO4 ·7H2 O 7. 9 g·L - 1 ,KH2 PO4 1. 5 g·L - 1 ,NH4 Cl 0. 3 g·L - 1 ,MgSO4 ·7H2 O 0. 1 g·L - 1 , 丁二酸二鈉4. 7 g·L - 1 ,KNO3 2. 0 g·L - 1 ,NaNO2 1. 0 g·L - 1 組成,pH 值在7 ~ 7. 5 之間。

　　3)平板分離培養(yǎng)基。平板分離培養(yǎng)基由Na2 HPO4 ·7H2 O 7. 9 g·L - 1 ,KH2 PO4 1. 5 g·L - 1 ,NH4 Cl0. 3 g·L - 1 ,MgSO4 ·7H2 O 0. 1 g·L - 1 , 丁二酸二鈉4. 7 g·L - 1 ,KNO3 2. 0 g·L - 1 ,NaNO2 1. 0 g·L - 1 ,瓊脂18 g·L - 1 組成。

　　1. 1. 3 馴化及平板分離

　　將選取的活性污泥樣品接種至富集培養(yǎng)基,然后在25 ℃ 和160 r·min - 1 的搖瓶中培養(yǎng)5 d,曝氣培養(yǎng)。之后將樣品接種至平板分離培養(yǎng)基,在25 ℃ 和160 r·min - 1 ,曝氣培養(yǎng)5 d。經(jīng)過平板劃線分離純化后得到菌株。

　　1. 1. 4 復(fù)篩

　　獲得的菌株使用模擬污水(表1)進(jìn)行復(fù)篩,在模擬污水的搖瓶中培養(yǎng)間歇曝氣,25 ℃ ,160 r·min - 1下培養(yǎng)5 d,進(jìn)行復(fù)篩。選擇TN 去除率高于90% 以上的菌株。

　　重復(fù)上述步驟,得到純化后菌株。

　　1. 1. 5 菌種鑒定

　　采用提取菌株的DNA 并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) ,擴(kuò)增后的PCR 樣品由上海生工進(jìn)行基因測序。具體方法為:

　　1)DNA 提取方法。于200 μL 的離心管中(預(yù)先加入30 μL 無菌雙蒸水)放入用接種環(huán)從培養(yǎng)基中挑出的數(shù)個(gè)單菌落,在94 ℃ 左右溫度下水浴加熱2 ~ 3 min 破壁,之后以該液體作為DNA 模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　2)PCR 擴(kuò)增引物及程序。上游引物P1:27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),下游引物P2:1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。

　　PCR 擴(kuò)增程序如下:94 ℃ 預(yù)變性4 min,30 個(gè)循環(huán)(94 ℃ 變性45 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸90 s),最終72 ℃ 延伸12 min。

　　反應(yīng)體系為:無菌雙蒸水40 μL,10 × PCR 反應(yīng)緩沖液5 μL,4 × dNTP 溶液1 μL,10 mmol·L - 1 引物各1 μL,Taq 酶1 個(gè)單位,DNA 模板2 μL。

　　PCR 結(jié)果經(jīng)上海生工生物工程公司測序,結(jié)果于美國NCBI 基因庫進(jìn)行比對。

　　1. 1. 6 細(xì)菌形態(tài)

　　利用掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。電鏡采用Philips XL-30。

　　1. 2 實(shí)驗(yàn)裝置

　　1. 2. 1 反應(yīng)器構(gòu)建

　　本研究采用平行裝置運(yùn)行法,即以同樣運(yùn)行條件下的2 個(gè)相同的膜曝氣生物反應(yīng)器進(jìn)行水處理,其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置加入篩選菌株運(yùn)行(增強(qiáng)型反應(yīng)器),而另一個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置不加篩選菌株(平行反應(yīng)器),作為平行實(shí)驗(yàn)裝置。

　　反應(yīng)器示意如圖1。反應(yīng)器裝置為圓柱形,膜組件置于反應(yīng)器中央,呈倒傘型。反應(yīng)器容積為5 L。膜組件為聚丙烯疏水性膜,有效面積為0. 2 m2 ,平均外徑為0. 5 mm,壁厚50 um,截留分子量為10 萬道爾頓。供氣壓力為7. 0 kPa。進(jìn)水由蠕動泵從廢水池中抽出后,注入反應(yīng)器中,反應(yīng)器中的混合液經(jīng)曝氣膜上生物膜處理后自流出水。

　　2 組反應(yīng)器構(gòu)造相同,不同點(diǎn)是膜曝氣組件膜面生物膜微生物組分不同。2 組反應(yīng)器平行運(yùn)行。加入所篩菌株的反應(yīng)器簡稱為增強(qiáng)型反應(yīng)器,不加所篩菌株反應(yīng)器成為平行反應(yīng)器。

　　1. 2. 2 掛膜

　　2 組反應(yīng)器均采用間歇曝氣的運(yùn)行方式進(jìn)行掛膜,平行反應(yīng)器接種污泥為西安市第四污水處理廠A2 /O 中曝氣池中活性污泥與曝氣沉砂池出水(表1)的混合液(體積比1 ∶ 1)(其中活性污泥投加量為4 g·L - 1 )。增強(qiáng)型反應(yīng)器接種污泥為西安市第四污水處理廠A2 / O 中曝氣池中活性污泥、篩菌菌懸液(富集培養(yǎng)基培養(yǎng))、曝氣沉砂池出水(表1) 的混合液(體積比1 ∶ 1 ∶ 1) (其中活性污泥、篩菌菌懸液投加量均為2 g·L - 1 )。

　　將混合液以懸浮態(tài)分別加入到各自反應(yīng)器中,循環(huán)24 h 后排空,重新加入混合液后繼續(xù)進(jìn)行循環(huán),一周后觀察到膜上有黃褐色生物膜形成,于是開始連續(xù)進(jìn)水并逐漸加大進(jìn)水負(fù)荷,15 d 后膜面黃褐色生物膜加厚并布滿膜面,認(rèn)為掛膜成功。

　　1. 3 實(shí)驗(yàn)用水

　　實(shí)驗(yàn)用水采用西安市第四污水廠曝氣沉砂池出水,水質(zhì)情況如表1 所示。

表1　廢水水質(zhì)情況

　　1. 4 水質(zhì)測定方法

　　COD、氨氮和總氮等測定方法均參考《水和廢水監(jiān)測方法》第4 版。其中COD 測定方法為重鉻酸鉀法(P210-213);氨氮測定方法為納氏試劑光度法(P276-281);總氮測定方法為過硫酸鉀氧化紫外分光光度法(P254-257)。測定數(shù)據(jù)均做平行實(shí)驗(yàn),取均值。

　　1. 5 變性梯度凝膠電泳( DGGE)

　　取1 000 μL 的生物膜樣品(超聲震蕩30 min),進(jìn)行1. 1. 5 的步驟,完成后取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物80 μL 在JY-TD331 型DGGE 電泳儀中進(jìn)行分離。其中,聚丙烯酰胺濃度為8% ,凝膠厚度0. 75 mm。凝膠變性梯度采用30% ~ 70% 。電泳緩沖液為1 × TAE(三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸),電泳溫度60 ℃,電壓150 V,電泳時(shí)間7. 5 h。電泳完成后,采用溴化乙錠(EB)染色法染色20 min,之后在紫外燈下觀察拍照。

　　2　運(yùn)行結(jié)果與討論

　　2. 1 菌種鑒定

　　經(jīng)過復(fù)篩后,一株脫氮率在90% 以上的菌株被篩選出來。圖2 為菌株的掃描電鏡圖片,為短桿狀。菌株為革蘭氏染色陰性菌。

　　圖3 給出了菌株DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳,從圖中可以看出,陰性對照良好。PCR 擴(kuò)增序列可以進(jìn)行測序,經(jīng)上海生工公司測序后,結(jié)果輸入NCBI 數(shù)據(jù)庫比對可初步鑒定為假單胞菌Pseudomonassp. 菌屬(表2)。

表2　菌株測序結(jié)果

　　2. 2 污染物處理效果

　　根據(jù)汪舒怡等的研究結(jié)果,采用水力停留時(shí)間為5 h,運(yùn)行負(fù)荷為7. 6 g COD·(m2 ·d) - 1 。由于處理的水樣及選取的污泥均取自同一污水廠,因此本研究未進(jìn)行污泥馴化,掛膜后直接進(jìn)入污染物去除階段,主要考察平行反應(yīng)器對污水的去除效果。圖4 為運(yùn)行期污染物去除的效果。

　　從圖4(a)中可以看出,2 組反應(yīng)器COD 的去除效率均較高,COD 的去除率基本穩(wěn)定在85% 以上,增強(qiáng)型反應(yīng)器中比平行反應(yīng)器的COD 的去除率高出約2% ~ 3% ,說明所篩菌株反硝化時(shí)消耗了一定的碳源。

　　圖4(b)顯示了氨氮隨時(shí)間的運(yùn)行結(jié)果,氨氮去除率可達(dá)到90% 以上,氨氮去除率在兩種反應(yīng)器中也較為接近,這說明膜曝氣生物反應(yīng)器工藝對氨氮有較好的去除。

　　圖4(c)為總氮的去除情況,2 組反應(yīng)器對總氮的去除也很好,顯示了膜曝氣生物反應(yīng)器工藝脫氮性能的優(yōu)越性。從運(yùn)行開始,增強(qiáng)型反應(yīng)器比平行反應(yīng)器的要高出5% 左右,隨著運(yùn)行時(shí)間的增加,總氮有了更好的去除,增強(qiáng)型反應(yīng)器比平行反應(yīng)器脫氮率高出10% 左右,總氮去除率達(dá)到85% ,這說明篩菌微生物起到了很好的脫氮作用。

　　2. 3 膜面微生物變化

　　為了更好地了解膜面微生物的組分,對運(yùn)行后期膜曝氣上生物膜進(jìn)行了變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。之后割膠,再按1. 1. 5 的方法測序,得到結(jié)果如圖5 及表3 所示。從圖5 可以看出,2 組反應(yīng)器的膜面生物多樣性較好,條帶比對顯示,微生物種類基本一致,僅僅在亮度上有所不同,尤其是條帶6,可以看出,增強(qiáng)型反應(yīng)器比平行反應(yīng)器增多,應(yīng)該為所篩菌株。經(jīng)測序后的結(jié)果表3 中可以證實(shí)。從微觀上證明了所篩菌種發(fā)揮了重要作用。

表3　DGGE 圖譜中分離出條帶測序結(jié)果

　　從表3 中可以看出,條帶中表現(xiàn)出的菌株為Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas sp. 亞硝化單胞菌屬,Nitrosospira 亞硝化螺菌屬,其余則為污染物降解菌,如變形桿菌屬( Uncultured beta proteobacteriumBa1. 0, Uncultured beta proteobacterium Ch6S)。

　　2. 4 純菌株獨(dú)立掛膜研究

　　為了進(jìn)一步對篩選的菌株獨(dú)立掛膜,考察是否該菌株確有好氧反硝化的作用,本研究在傳統(tǒng)反應(yīng)器基礎(chǔ)上僅添加所篩選菌株構(gòu)建獨(dú)立掛膜反應(yīng)器,并同時(shí)再次運(yùn)行平行實(shí)驗(yàn)裝置,3 組進(jìn)行對比研究。掛膜方式及運(yùn)行與1. 2. 2 及2. 2 相同。經(jīng)運(yùn)行30 d后發(fā)現(xiàn),與2. 2 污染物去除結(jié)果相類似,3 組反應(yīng)器COD 的去除效率均較高,COD 去除率基本穩(wěn)定在85% 以上,相差不大。氨氮隨時(shí)間的運(yùn)行結(jié)果,氨氮去除率可達(dá)到90% 以上,氨氮去除率在3 種反應(yīng)器中也較為接近。獨(dú)立掛膜反應(yīng)器與增強(qiáng)型反應(yīng)器對總氮的去除率分別達(dá)到85% 和84% ,而平行反應(yīng)器對總氮的去除率為73% 。從圖4 看出,增強(qiáng)型反應(yīng)器與平行反應(yīng)器對總氮的去除率分別達(dá)到85% 和75% 。因此,重復(fù)實(shí)驗(yàn)與前期實(shí)驗(yàn)無顯著性差異。

　　研究認(rèn)為:獨(dú)立掛膜反應(yīng)器脫氮效果良好,但是污染去除效果與增強(qiáng)型反應(yīng)器相差不大,從經(jīng)濟(jì)角度和生物多樣性角度認(rèn)為增強(qiáng)型反應(yīng)器更適合于污水處理。具體參見污水寶商城資料或http://wlmqsb.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3　結(jié)論

　　1)篩選一株好氧反硝化菌,其脫氮效率為90% 以上,經(jīng)鑒定為假單胞菌Pseudomonas sp. 。

　　2)將菌株添加到膜曝氣生物反應(yīng)器構(gòu)建高效脫氮菌群增強(qiáng)膜曝氣生物反應(yīng)器來處理市政污水。研究表明,對于高效脫氮菌的附著下形成的增強(qiáng)型膜曝氣生物反應(yīng)器,在COD 負(fù)荷為7. 6 g COD·(m2 ·d) - 1 ,水力停留時(shí)間為5 h 下,可使污染物的COD,氨氮及總氮的去除率分別保持在87% 、98% 和85%以上。

　　3)DGGE 分析顯示,2 組反應(yīng)器的膜面生物多樣性較好。測序結(jié)果表明,篩選菌種在增強(qiáng)型膜曝氣生物反應(yīng)器中比平行膜曝氣生物反應(yīng)器明顯增多,從微觀上證明了菌種發(fā)揮了重要作用。