為預(yù)防和治療畜禽疾病，獸用抗生素被廣泛用作飼料添加劑。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，磺胺類是常用抗生素之一，大約占磺胺類抗生素總使用量的45%。所使用的抗生素在動(dòng)物腸道中不能完全代謝，最終通過糞便和尿液排出體外進(jìn)入到環(huán)境中。在畜禽養(yǎng)殖廢水中，該類藥物的檢出濃度較高�？股�素的增加，使抗性基因在非致病和致病性細(xì)菌之間傳播，會(huì)危害人類健康。

畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)通常建有完整的生化處理工藝。但其不能有效去除抗生素，特別是磺胺類抗生素在尾水中仍保持高濃度，需另做處理再排放到環(huán)境中。由于人工濕地建設(shè)和維護(hù)成本低、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好、污染物去除率高，因此被廣泛應(yīng)用于污水二級(jí)或三級(jí)處理，也是目前處理畜禽廢水的常見工藝之一。垂直流人工濕地是人工濕地技術(shù)的主流工藝之一，其對(duì)污染物的去除效率及可承受的污染負(fù)荷都普遍高于表面流和水平潛流人工濕地，但抗生素會(huì)對(duì)垂直流人工濕地的運(yùn)行處理狀況產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，在人工濕地中如何應(yīng)對(duì)可能的抗生素影響，保障系統(tǒng)正常運(yùn)行，實(shí)現(xiàn)抗生素和常規(guī)污染物的有效去除，需要做進(jìn)一步研究。

鐵碳微電解作為廣泛使用的高級(jí)氧化技術(shù)之一，已被證明是一種高效處理制藥廢水、重金屬?gòu)U水、養(yǎng)殖廢水和其他類型廢水的低成本技術(shù)。鐵碳微電解法是將一定比例的鐵和碳浸入廢水中而形成無(wú)數(shù)微小的原電池，廢水作為電解質(zhì)溶液產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，對(duì)污染物進(jìn)行氧化，從而使污染物分解為易降解物質(zhì)。鐵碳材料具有良好的吸附能力，在微電解和吸附的共同作用下，可以有效去除廢水中的各種污染物。因此，有研究利用鐵碳微電解技術(shù)對(duì)抗生素廢水進(jìn)行預(yù)處理，并取得了良好的效果。同時(shí)，有研究將微電解技術(shù)引入人工濕地后，發(fā)現(xiàn)其能有效應(yīng)對(duì)農(nóng)藥等污染物的沖擊，保證了人工濕地系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行。

為了提高人工濕地系統(tǒng)對(duì)抗生素的適應(yīng)性調(diào)整，筆者將鐵碳微電解技術(shù)與人工濕地相結(jié)合，構(gòu)建了微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)，同時(shí)構(gòu)建普通上升垂直流人工濕地系統(tǒng)作為對(duì)照，研究?jī)煞N人工濕地系統(tǒng)對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水中磺胺二甲基嘧啶（SM2）的去除效果與凈化機(jī)理，并通過酶活性測(cè)定和高通量測(cè)序系統(tǒng)分析了濕地系統(tǒng)中基質(zhì)酶活性和微生物群落的變化，明確了磺胺二甲基嘧啶對(duì)兩種人工濕地微生態(tài)系統(tǒng)的影響規(guī)律，旨在為畜禽養(yǎng)殖廢水尾水中抗生素的去除探索有效途徑。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

采用PVC材料制成兩個(gè)尺寸相同的人工濕地實(shí)驗(yàn)裝置（見圖1）。裝置長(zhǎng)為70cm，寬為50cm，高為65cm。微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱為A）自下而上依次填充鵝卵石（粒徑為2~3cm）、鐵碳（粒徑為1~1.5cm）、沸石（粒徑為0.5~1cm）；普通上升垂直流人工濕地系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱為B）自下而上依次填充鵝卵石（粒徑為2~3cm）、礫石（粒徑為1~1.5cm）、沸石（粒徑為0.5~1cm）；并用鋁箔包裹避光，在A、B系統(tǒng)的沸石層分別種植6株長(zhǎng)勢(shì)相似的美人蕉。植物生長(zhǎng)補(bǔ)光燈日照時(shí)長(zhǎng)為10h。

鐵碳的制備參照文獻(xiàn)，鐵粉、碳粉、高嶺土和氯化銨按照質(zhì)量比為2.40∶3.60∶4.00∶0.05攪拌均勻后加水調(diào)勻，其含水率控制在10%~12%之間，采用球形造粒機(jī)制成粒徑為1~1.5cm的球狀填料，并在110℃的烘箱中干燥2h，將其放在馬福爐中，在900℃下焙燒4h，自然冷卻至室溫后制成。

1.2 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行及采樣

采用桂林市雁山污水處理廠出水啟動(dòng)系統(tǒng)，使用蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)水，HRT設(shè)置為48h，待兩個(gè)系統(tǒng)中植物生長(zhǎng)正常，且對(duì)常規(guī)污染物的去除率穩(wěn)定運(yùn)行至少一個(gè)月后視為啟動(dòng)完成，可開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

用葡萄糖（400mg/L）、磷酸二氫鉀（15mg/L）、三水合乙酸鈉（54mg/L）、碳酸氫鈉（111mg/L）、硫酸銨（108mg/L）、二水合氯化鈣（30mg/L）配制成實(shí)驗(yàn)廢水，進(jìn)水COD、NH4+-N和TP平均濃度分別為（400.99±4.28）、（26.23±0.28）和（3.90±0.23）mg/L。采用連續(xù)流運(yùn)行方式，每2d測(cè)定一次進(jìn)出水中污染物濃度。選用磺胺二甲基嘧啶作為目標(biāo)抗生素，其在模擬廢水中的添加濃度設(shè)定為100μg/L。具體實(shí)驗(yàn)步驟分三個(gè)階段，其中第一階段為向A、B系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)實(shí)驗(yàn)廢水兩個(gè)月后，將濕地系統(tǒng)基質(zhì)分為三等份，從基質(zhì)上表面往下5~10、30~40cm兩個(gè)范圍設(shè)6個(gè)取樣點(diǎn)，把所取基質(zhì)放入無(wú)菌錐形瓶中，用無(wú)菌緩沖液淹沒基質(zhì)，充分振蕩后，用0.22μm孔徑濾膜過濾緩沖液，濾膜上的沉淀作為測(cè)試微生物多樣性和基質(zhì)酶活性的樣品；繼續(xù)向A、B系統(tǒng)進(jìn)實(shí)驗(yàn)廢水兩個(gè)月（第二階段），向廢水中加入SM2并混勻，再次連續(xù)進(jìn)水兩個(gè)月后，提取基質(zhì)，測(cè)試微生物多樣性和基質(zhì)酶活性（第三階段），提取方法與第一階段相同。

1.3 分析項(xiàng)目及方法

COD采用重鉻酸鹽法測(cè)定，NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測(cè)定，TP采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定，TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定。

水樣中的SM2采用HLB小柱凈化富集，結(jié)合高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析，具體操作如下：取300mL水樣用0.45μm水系濾膜抽濾，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3.0，加入0.3g的Na2EDTA；HLB小柱用5mL甲醇、5mL超純水預(yù)洗，將備用水樣過柱，以5mL/min的流速流經(jīng)HLB小柱，擠干；用10mL甲醇洗脫，收集；用氮?dú)獯蹈�，加�?/span>1mL流動(dòng)相旋渦溶解，過0.22μm濾膜，隨后用于HPLC分析。色譜條件：色譜柱為AgilentTC-C18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相乙腈（A）∶0.1%甲酸（B）為15∶85，流速為1mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm。

脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定；脫氫酶活性采用TTC比色法進(jìn)行測(cè)定；堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測(cè)定。微生物DNA提取采用FastDNASPINKitForSoil（MPBiotechnology）試劑盒來完成。PCR擴(kuò)增所用的引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），利用IlluminaMiSeq250儀器完成測(cè)序分析，測(cè)序由上海派森諾生物科技有限公司來完成。使用Vsearch軟件過濾高質(zhì)量的嵌合序列。采用UPARCE以97%的序列同一性對(duì)操作單元（OTU）進(jìn)行聚類。

2、結(jié)果與討論

2.1 污染物去除效果

進(jìn)出水中COD、NH4+-N、TP和TN濃度的變化見圖2。A系統(tǒng)對(duì)常規(guī)污染物的去除率顯著高于B系統(tǒng)。第一階段，A系統(tǒng)對(duì)COD、NH4+-N、TP和TN的去除率分別為（93.74±7.46）%、（70.79±3.67）%、（90.50±13.78）%和（62.86±4.07）%，而B系統(tǒng)的相應(yīng)去除率分別為（67.27±7.71）%、（55.10±4.23）%、（61.94±8.23）%和（47.47±4.71）%。在第二階段發(fā)現(xiàn)，提取基質(zhì)后對(duì)兩種濕地系統(tǒng)中微生物群落均造成了影響。對(duì)于外界影響，Ａ系統(tǒng)可以更快地調(diào)整適應(yīng)，所以歷經(jīng)較短時(shí)間就恢復(fù)了高效處理能力；而B系統(tǒng)抵抗外界影響的能力較弱，去除率波動(dòng)較大。第三階段，A系統(tǒng)對(duì)幾種常規(guī)污染物的去除率與第一階段幾乎相同，總體保持了穩(wěn)定且高效的處理效果；B系統(tǒng)對(duì)常規(guī)污染物的去除率下降較明顯且波動(dòng)較大，COD、NH4+-N、TP和TN分別平均下降了3.80%、14.94%、30.97%和10.63%。這一過程表明在SM2的脅迫下，微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)可以穩(wěn)定且有效地去除常規(guī)污染物，而普通上升垂直流人工濕地系統(tǒng)則受到了較大的沖擊。

進(jìn)出水中SM2濃度的變化如圖3所示。

從圖3可知，與B系統(tǒng)相比，A系統(tǒng)出水中SM2濃度更低，系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后對(duì)SM2的去除率為（76.64±2.04）%，且能在10d左右達(dá)到穩(wěn)定，而B系統(tǒng)對(duì)SM2的去除率為（36.37±19.45）%，且一直處于波動(dòng)狀態(tài)，50d后依舊難以穩(wěn)定。因此，從對(duì)SM2的去除效果來看，A系統(tǒng)不僅在去除率方面優(yōu)勢(shì)明顯，而且系統(tǒng)的穩(wěn)定性也顯著強(qiáng)于B系統(tǒng)，這也顯示了B系統(tǒng)缺乏應(yīng)對(duì)SM2沖擊的能力，在相對(duì)較高濃度SM2的長(zhǎng)期脅迫下難以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定運(yùn)行。

2.2 基質(zhì)酶活性的變化

基質(zhì)酶在污水凈化中起關(guān)鍵作用，其是微生物分泌的一類非常重要的生物催化劑，能參與多種有機(jī)物反應(yīng)，進(jìn)而提高人工濕地系統(tǒng)對(duì)污染物的去除效率。其中脲酶、磷酸酶和脫氫酶與污水中氮、磷和有機(jī)物的去除密切相關(guān)。在模擬廢水中投加SM2后，A、B系統(tǒng)中基質(zhì)酶活性的變化見表1。

總體來看，A、B系統(tǒng)在投加SM2后，各項(xiàng)酶指標(biāo)均有下降，表明SM2作為一種廣譜性抗生素對(duì)微生物群落的影響是明確的。在A系統(tǒng)中脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性的變化率顯著低于B系統(tǒng)。鐵碳微電解可有效降解磺胺類抗生素的作用機(jī)理已有報(bào)道，推測(cè)微電解首先作用于S—N鍵，使其斷裂，然后分別作用于苯環(huán)和特征官能團(tuán)，得到一系列最終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物。鐵碳對(duì)SM2的分解作用能夠大幅降低其對(duì)A系統(tǒng)的毒性脅迫，這在很大程度上保障了系統(tǒng)的原有功效。B系統(tǒng)則缺乏有效的應(yīng)對(duì)機(jī)制，受到較高濃度SM2的沖擊時(shí)微生物種群受到較大程度的影響，導(dǎo)致脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性大幅度降低，系統(tǒng)對(duì)常規(guī)污染物的去除效果下降得也比較顯著。

A系統(tǒng)中，位于上層的沸石層酶活性的變化率略小于下層的鐵碳層。圖4為A系統(tǒng)中不同基質(zhì)層SM2濃度的變化。可知，A系統(tǒng)中，SM2在鐵碳層和沸石層的平均濃度分別為67.23和31.96μg/L，表明鐵碳層確實(shí)降低了SM2濃度。因此，上層沸石層的SM2濃度更低，上層中微生物受到的影響也更小，體現(xiàn)出來的酶活性的變化率也更小一些。

2.3 微生物群落的變化

圖5為A、B系統(tǒng)在屬水平上的微生物Heatmap圖（1為投加SM2前，2為投加SM2后）。

從圖5可以看出，投加SM2前，A系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)菌屬分別為Trichococcus和Bacillus。投加SM2后，A系統(tǒng)中以去除常規(guī)有機(jī)污染物為主的主要優(yōu)勢(shì)屬Trichococcus的豐度（5.28%）降低至0.31%，而OPB41的豐度由7.12%升高至10.20%，此外Cloacibacterium的豐度（0.02%）升高至19.89%，成為主要優(yōu)勢(shì)屬。檢測(cè)到除氮菌Desulfomicrobium（3.69%）和Cupriavidus（0.58%）的豐度分別升高至5.41%和4.69%。反硝化細(xì)菌Bacillus（8.24%）和Rhodopseudomonas（4.37%）的豐度分別降低至2.12%和0.12%，Acinetobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Thermomonas和Thiobacillus的豐度由0.34%、0.14%、0.33%、0.03%和0.18%分別升高至16.69%、10.44%、3.09%、5.81%和2.83%，其中Acinetobacter、Pseudomonas和Bacillus也是常見的除磷菌。系統(tǒng)中存在豐富的功能微生物屬，對(duì)常規(guī)污染物有良好的去除效果，且SM2在不同程度上影響著細(xì)菌結(jié)構(gòu)。

投加SM2后，A系統(tǒng)經(jīng)短暫波動(dòng)后即達(dá)到平穩(wěn)、高效的運(yùn)行狀態(tài)。經(jīng)分析，系統(tǒng)的上、中兩層微生物的Chao1指數(shù)分別為3533.06和2706.69，仍然維持了較高的微生物豐度。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到影響抗生素去除的微生物屬包括Cloacibacterium、Lysobacter、Acinetobacter和Brevundimonas等，其豐度均有顯著增加，這些耐藥菌是去除抗生素的優(yōu)勢(shì)菌屬，可以直接破壞和修飾抗生素使其失活。推測(cè)其原因很可能是鐵碳微電解有效降解了磺胺類抗生素，導(dǎo)致對(duì)微生物種群的脅迫效應(yīng)下降，低濃度的SM2和鐵碳微電解作用刺激了功能微生物的活性，促進(jìn)以Cloacibacterium為代表的菌屬生長(zhǎng)，使A系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)得到適應(yīng)性調(diào)整和二次馴化。經(jīng)過該過程，A系統(tǒng)中再次形成了豐富的功能菌屬，并能夠維持對(duì)污染物的有效去除，保證系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行。

投加SM2前，B系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)菌屬分別為Chlorobaculum和Chlorobium。投加SM2后，B系統(tǒng)中主要優(yōu)勢(shì)屬Chlorobaculum（10.93%）和Chlorobium（29.53%）的豐度分別降低至3.89%和0.58%，而Trichococcus和Halomonas的豐度分別由2.54%和0.13%升高至7.14%和11.21%，成為新的主要優(yōu)勢(shì)菌屬。脫氮菌Chlorobium的豐度降低了28.95%。反硝化細(xì)菌Hydrogenophaga的豐度（2.29%）升高至2.31%，硝化細(xì)菌Azospira的豐度由0.28%增加至2.30%。與抗生素去除有關(guān)的微生物Lysobacter的豐度由0.11%升高至5.12%。

投加SM2后，B系統(tǒng)去除常規(guī)污染物時(shí)產(chǎn)生了大幅度波動(dòng)，去除效果下降明顯。該系統(tǒng)上、中兩層微生物的Chao1指數(shù)分別由3695.20和3704.07降低至3054.57和1199.88，總體微生物量明顯下降。在B系統(tǒng)中也僅發(fā)現(xiàn)了一種與抗生素去除有關(guān)的優(yōu)勢(shì)菌屬（Lysobacter），表明在高濃度SM2的脅迫下，該系統(tǒng)受到顯著沖擊，難以進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性調(diào)整，因此B系統(tǒng)的穩(wěn)定性及對(duì)污染物的去除效果均大幅度下降。

3、結(jié)論

①在SM2的脅迫下，微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)仍能維持穩(wěn)定、高效的運(yùn)行狀態(tài)，對(duì)常規(guī)污染物與SM2均表現(xiàn)出了更好的去除效果，而普通上升垂直流人工濕地系統(tǒng)難以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定運(yùn)行，其對(duì)常規(guī)污染物與SM2的去除效果均顯著低于微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)。

②基質(zhì)酶活性的變化情況表明，微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)中脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性的變化率顯著低于普通上升垂直流人工濕地系統(tǒng)。主要原因是微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)中鐵碳微電解作用降低了SM2對(duì)系統(tǒng)的毒性脅迫，有效維持了基質(zhì)酶的活性，而普通上升垂直流人工濕地系統(tǒng)受到較高濃度SM2的沖擊，微生物種群受到較大程度的影響，脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性大幅度降低。

③鐵碳微電解對(duì)SM2的分解作用降低了脅迫效應(yīng)，較低濃度的SM2可能促使微生物屬發(fā)生二次馴化，致使去除抗生素的微生物屬Cloacibacterium、Lysobacter、Acinetobacter和Brevundimonas等的豐度均顯著增加，群落結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性調(diào)整保證了微電解耦合上升垂直流人工濕地系統(tǒng)穩(wěn)定、高效的運(yùn)行狀態(tài)；普通上升垂直流人工濕地系統(tǒng)在高濃度SM2的脅迫下，難以實(shí)現(xiàn)微生物結(jié)構(gòu)適應(yīng)性調(diào)整和二次馴化，對(duì)污染物的去除效果明顯下降。（來源：廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院）