沼渣是有機物發(fā)酵后剩余的固形物質(zhì)，富含腐殖質(zhì)、腐殖酸、微量營養(yǎng)元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，可以作為良好的土壤改良劑。隨著農(nóng)村沼氣池的普及，沼渣產(chǎn)量越來越大，預(yù)計2030年我國的沼氣年產(chǎn)量將超過3.0×1028m3，沼渣年產(chǎn)量將達到3.6×1023t，因此沼渣處置成了亟待解決的環(huán)境問題。沼渣還田是目前沼渣資源化的主要方式，然而未充分腐熟的沼渣存在致病菌，而且會在土壤中繼續(xù)發(fā)酵消耗氧氣而產(chǎn)生較多熱量和有毒有害氣體，因此未充分腐熟的沼渣還田會對農(nóng)作物生長產(chǎn)生抑制作用，如抑制種子發(fā)芽、導(dǎo)致幼苗黃化、致使農(nóng)作物生長速率低下甚至死亡等。沼渣堆肥處理可以穩(wěn)定有機物并抑制致病菌。目前，沼渣堆肥效率低是普遍性問題。本研究通過分析沼渣堆肥的微生境因子與沼渣堆肥的水溶性有機物(DOM)穩(wěn)定化指標的相互關(guān)系構(gòu)建沼渣堆肥穩(wěn)定化調(diào)控技術(shù)，用以加速腐殖質(zhì)向腐殖酸轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)沼渣堆肥的快速穩(wěn)定化。
1、材料與方法
1.1 堆肥原料
沼渣取自北京順義某農(nóng)戶家庭，豬糞和雞糞取自河北樂亭某實驗基地，堆肥前將這3種堆肥原料晾干，其中豬糞碳含量較高，雞糞氮含量較高，而沼渣纖維含量較高。玉米秸稈也取自河北樂亭某實驗基地，用于調(diào)整堆肥原料的碳氮比(C/N)，使用前粉碎至粒徑為0.1~0.5cm。
1.2 堆肥設(shè)備
堆肥設(shè)備主體部分為盛放堆料的圓柱形反應(yīng)箱，由不銹鋼罐體構(gòu)成，高度和底面直徑分別為0.40、0.33m，容積為34L，位于恒溫箱中，通過溫差控制裝置監(jiān)測和控制溫度，上方有氣體測定裝置，可在線監(jiān)測O2、H2S、CO2等氣體，同時配備有氣泵、氣體流量計、溫差控制裝置、氣體過濾裝置等，試驗裝置示意圖如圖1所示。
1.3 試驗設(shè)計
表1設(shè)計了堆肥原料沼渣、豬糞、雞糞的三因素兩水平正交試驗3013，通過玉米秸稈調(diào)整堆肥原料C/N后得到T1~T4不同堆肥處理物料的理化性質(zhì)，如表2所示，堆肥過程中實時監(jiān)測溫度和含水率變化，分別在第0天(升溫期)、第6天(高溫期)、第14天(降溫期)和第30天(腐熟期)各采兩份約100g的樣品，一份4℃保存用于監(jiān)測理化指標，另一份-20℃保存用于監(jiān)測生物學(xué)指標。
1.4 指標監(jiān)測方法
含水率采用差重法3013測定;有機質(zhì)采用燒失量法測定;總氮采用堿性過硫酸鉀消解/紫外分光光度法測定;氨氮(AN)用納氏試劑光度法測定;pH用梅特勒FE28-StandardpH計測定;總碳用耶拿multiN/C2100總有機碳測定儀測定;纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定參照《飼料中粗纖維的含量測定》(GB/T6434—2022);C/N為總碳與總氮的質(zhì)量比。
種子發(fā)芽指數(shù)(GI)用油菜種子發(fā)芽試驗法進行測定。
用DP336土壤脫氧核糖核酸(DNA)試劑盒提取堆肥樣品中的總DNA，通過質(zhì)量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量后，以提取的DNA為模板，以534R和357F為特異性引物，進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，PCR產(chǎn)物用變性梯度凝膠電泳(DGGE)鑒定，最后通過計算香農(nóng)指數(shù)(SWI)解釋不同堆肥樣品的細菌群落多樣性。
DOM樣品的前處理方法參照文獻，使用總有機碳測定儀測定DOM濾液的溶解有機碳(DOC)，然后用UNICOUV-4802雙光束紫外可見分光光度計掃描DOM紫外吸收光譜，掃描波長為200~700nm，掃描間隔為1nm。測定254、280nm的吸光度，并分別計算與DOC的比值，分別記為SUVA254、SUVA280，分別用來表征腐殖酸的腐殖化程度和不飽和度、有機質(zhì)的芳構(gòu)化程度和分子量。測定250、365nm的吸光度(分別記為E250和E365)，并計算E250/E365，也可用來表征DOM的芳香性和分子量。測定253、203nm的吸光度(分別記為E253和E203)，并計算E253/E203，用來表征極性官能團。
1.5 數(shù)據(jù)處理
用IBMSPSSStatistics22.0軟件進行光譜學(xué)指標的單因素方差分析;用Canoco5.0軟件進行冗余分析(RDA)，揭示微生境因子對DOM光譜學(xué)指標變化的貢獻率;用IBMSPSSAmos26.0軟件構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型，識別微生境因子的作用途徑。
2、結(jié)果與分析
2.1 細菌群落演替與多樣性變化
DGGE是分析細菌群落多樣性的有效方法，能有效反映不同生態(tài)環(huán)境中細菌群落的演替。由圖2可見，16SrRNA基因片段的條帶1、2、3、5、7幾乎存在于各個處理的整個堆肥過程中，這些細菌可能在堆肥過程中降解有機物方面起重要作用。4個處理的細菌群落多樣性在高溫期和降溫期發(fā)生了明顯變化，說明原料配比不同導(dǎo)致堆肥理化性質(zhì)不同，進而影響細菌群落多樣性。T2和T3沼渣含量低，雞糞、豬糞的相對含量高，更易于復(fù)雜有機物分解轉(zhuǎn)化為腐殖酸，從而提高了細菌群落的多樣性。
2.2 沼渣堆肥DOM穩(wěn)定化表征
用DOM的4種光譜學(xué)指標(SUVA254、SUVA280、E253/E203、E250/E365)表征堆肥腐熟度，結(jié)果如圖3所示。4個處理中SUVA254、SUVA280、E253/E203在堆肥過程中總體呈上升趨勢，而E250/E365總體呈下降趨勢，由此說明隨著堆肥進行，DOM分子量、分子結(jié)構(gòu)的縮合度和不飽和度逐漸變大，DOM腐殖化程度加深。單因素方差分析結(jié)果顯示，各個處理的4種DOM光譜學(xué)指標從升溫期到腐熟期均差異顯著，結(jié)合細菌群落DGGE氣泡圖(見圖2)，可以說明堆肥從開始到結(jié)束由于有機質(zhì)構(gòu)成發(fā)生變化導(dǎo)致細菌群落發(fā)生變化。升溫期的DOM光譜學(xué)指標排序發(fā)現(xiàn)，SUVA254、SUVA280、E253/E203排序均為T4<T1<T2<T3，堆肥過程總體呈上升趨勢，表明T3處理的堆肥腐熟程度最好，穩(wěn)定化程度最高。因此按T3處理的原料配比最有利于沼渣堆肥DOM穩(wěn)定化。
2.3 影響DOM穩(wěn)定化的關(guān)鍵微生境因子識別
RDA通過原始變量與解釋變量之間的相關(guān)性分析引起原始變量差異的原因。本研究通過RDA來探究堆肥微生境因子與DOM光譜學(xué)指標之間的響應(yīng)關(guān)系，結(jié)果如圖4所示，前兩軸的特征值占到了總特征值的99.02%。原始變量為DOM光譜學(xué)指標，用實心箭頭連線表示;解釋變量為微生境因子，用空心箭頭連線表示。解釋變量連線在DOM光譜學(xué)指標連線上的投影(即余弦值)表示微生境因子對DOM光譜學(xué)指標的方差貢獻率大小。連線間的夾角反映了變量間的相關(guān)性，夾角越接近0°表示越呈正相關(guān)性，越接近180°表示越呈負相關(guān)性，越接近90°表示越不相關(guān)。由圖4可以看出，SUVA254、SUVA280、E253/E203與GI、pH、SWI呈正相關(guān)性，與AN呈負相關(guān)性;而E250/E365與GI、pH、SWI呈負相關(guān)性，與AN呈正相關(guān)性。綜合分析表明，GI對DOM光譜學(xué)指標方差貢獻率最大。
2.4 微生境因子的作用途徑分析
為了更深入地探究堆肥微生境因子對DOM光譜學(xué)指標的作用途徑，采用能夠直觀表示生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的結(jié)構(gòu)方程模型進行分析。圖5展示了4種微生境因子和4種DOM光譜學(xué)指標之間的因果關(guān)系。其中，pH與GI呈顯著正相關(guān)性，AN與GI呈顯著負相關(guān)性，GI與DOM穩(wěn)定化指標SUVA254、SUVA280、E253/E203均存在顯著正相關(guān)性，與E250/E365存在顯著負相關(guān)性，這與KONG等的研究結(jié)果一致。由此可以得出，pH、AN通過影響GI間接作用于DOM光譜學(xué)指標，因此GI是作用路徑的關(guān)鍵。由圖5(b)還可以發(fā)現(xiàn)，SWI與SUVA280存在顯著正相關(guān)性，表明SWI在堆肥進程中對芳香族化合物含量升高具有促進作用，可能與微生物的芳香性代謝物有關(guān)。由圖5(d)發(fā)現(xiàn)，AN與E253/E203存在顯著負相關(guān)性，這與閆彩紅等的研究結(jié)果一致。綜上，GI是DOM穩(wěn)定化過程的關(guān)鍵微生境因子，pH、AN、SWI或直接或間接地也可影響堆肥穩(wěn)定化過程。
3、結(jié)論
(1)沼渣堆肥過程中，原料配比不同導(dǎo)致堆肥理化性質(zhì)不同，細菌群落多樣性各異，從而改變堆肥穩(wěn)定化進程，按沼渣5.85kg、豬糞8.490kg、雞糞8.190kg的原料配比，堆肥腐熟程度最好，穩(wěn)定化程度最高，最有利于沼渣堆肥的DOM穩(wěn)定化。
(2)GI對DOM光譜學(xué)指標方差貢獻率最大，是作用路徑的關(guān)鍵樞紐，直接作用于DOM穩(wěn)定化。pH、AN也可通過影響GI間接作用于DOM穩(wěn)定化，SWI在堆肥進程中對芳香族化合物含量升高具有促進作用。
(3)可以通過調(diào)控堆肥微生境因子(升高pH、GI、SWI，降低AN)來加速腐殖質(zhì)向腐殖酸轉(zhuǎn)化，達到提高DOM穩(wěn)定化程度的目的。（來源：聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院）
