與傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖相比，循環(huán)水養(yǎng)殖的方式環(huán)境污染較小、節(jié)水且具有高生物安全性，因此，在過(guò)去幾年中越來(lái)越受歡迎。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(recirculatingaquaculturesystem，RAS)一般由一個(gè)儲(chǔ)水單元、一系列并聯(lián)的培養(yǎng)池、連接的處理單元(過(guò)濾單元、生物處理單元和消毒單元)組成，是通過(guò)水處理技術(shù)去除養(yǎng)殖廢水中殘留的飼料、無(wú)機(jī)物和有機(jī)物后再用于養(yǎng)殖用水的過(guò)程。該養(yǎng)殖模式為封閉系統(tǒng)，養(yǎng)殖水體在整個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中都在設(shè)施中處理和重復(fù)使用。循環(huán)水水產(chǎn)養(yǎng)殖在淡水和海洋動(dòng)物的養(yǎng)殖中都有不同的應(yīng)用。與傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖相比，使用機(jī)械和生物過(guò)濾器處理可減少90%~99%的用水量，因此RAS的水循環(huán)利用技術(shù)使得對(duì)環(huán)境的影響小。

盡管循環(huán)水養(yǎng)殖有較多優(yōu)勢(shì)，但其并不能消除水產(chǎn)養(yǎng)殖的普遍問(wèn)題，例如，一些集約型水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)經(jīng)常依靠密集施用抗生素來(lái)提高養(yǎng)殖性能，抑制細(xì)菌性魚類病原體的生長(zhǎng)�？股�素在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的使用導(dǎo)致抗微生物藥物耐藥性(antimicrobialresistance，AMR)在水生環(huán)境中的傳播。由于過(guò)度使用抗生素，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，AMR的檢出率很高�？股�素抗性基因(antibioticresistancegenes，ARGs)可以通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)在細(xì)菌群體中快速傳播。水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中已檢測(cè)出主要為磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因。XIONG等在廣東多個(gè)養(yǎng)殖池塘中檢測(cè)的ARGs的相對(duì)豐度高達(dá)2.8×10−2。GAO等在我國(guó)多個(gè)海水養(yǎng)殖區(qū)中檢測(cè)出以bacA為主的大量ARGs，且海水沉積物分離出的細(xì)菌均有多耐藥性。因此，很多研究表明研究者們對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)成為環(huán)境中ARGs庫(kù)的擔(dān)憂日益加深。

近年來(lái)，人們對(duì)不使用獸藥和抗生素條件下生產(chǎn)有機(jī)食品的需求迅速增長(zhǎng)。然而，即使不使用抗生素的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)也不會(huì)使所有的AMR消除。水生環(huán)境中ARGs的存在取決于微生物群和人類活動(dòng)之間的復(fù)雜相互作用，包括養(yǎng)殖水體的徑流、外界的廢水和抗生素廢物的污染。在循環(huán)水養(yǎng)殖運(yùn)行過(guò)程中，養(yǎng)殖動(dòng)物排泄物和水體的理化條件不斷變化，例如，氮化合物會(huì)隨著時(shí)間的推移而積累，并可能嚴(yán)重影響細(xì)菌群落的系統(tǒng)發(fā)育組成，這通常被認(rèn)為是菌群ARGs變化的原因之一。然而，目前尚未系統(tǒng)地了解環(huán)境因子在促進(jìn)AMR在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中傳播的作用。

海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)作為新推廣的集約化養(yǎng)殖模式，已在沿海多地建立工廠化養(yǎng)殖，然而，關(guān)于海水RAS環(huán)節(jié)中ARGs和細(xì)菌群落的分布情況，系統(tǒng)中水處理環(huán)節(jié)對(duì)ARGs的處理效果以及系統(tǒng)中ARGs分布的影響因素的報(bào)道較少。為闡明循環(huán)水養(yǎng)殖中ARGs的分布特征及決定其傳播擴(kuò)散的影響因素，我們采用ARGs的高通量定量PCR和16SrRNA基因的高通量測(cè)序的方法，研究了2個(gè)不同的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中296種相關(guān)ARGs的分布和變化規(guī)律、細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和變化規(guī)律，以及ARGs和細(xì)菌群落、環(huán)境變量之間的相互關(guān)系，以期明確ARGs在工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式中的賦存特征，對(duì)進(jìn)一步控制循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中ARGs的擴(kuò)散傳播提供更多依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 樣本來(lái)源于采集

實(shí)驗(yàn)于2020年8月，選取大連地區(qū)的2個(gè)工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(1個(gè)為魚類養(yǎng)殖，1個(gè)為對(duì)蝦養(yǎng)殖)DY(養(yǎng)魚)和DX(養(yǎng)蝦)進(jìn)行樣品采集。循環(huán)水系統(tǒng)各環(huán)節(jié)工藝如圖1所示。保證采樣前一周內(nèi)沒(méi)有降水，且養(yǎng)殖過(guò)程中無(wú)抗生素類藥品的投放。實(shí)驗(yàn)分別采集循環(huán)水系統(tǒng)中的養(yǎng)殖池、微濾池、生物濾池和紫外池的水體樣品。每組于各個(gè)水池的不同位置采集5個(gè)樣本，每個(gè)樣品采800mL水樣，用于后續(xù)水系微孔濾膜的過(guò)濾。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)處理過(guò)程

1.2 水質(zhì)理化因子檢測(cè)

水體中化學(xué)需氧量(COD)使用COD快速檢測(cè)試劑盒(HACH，美國(guó))測(cè)量。根據(jù)《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB/T12763.4—2007)對(duì)水體中的其他理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定：總氮(TN)和總磷(TP)采用過(guò)硫酸鉀氧化法；氨氮(NH+4-N)采用靛酚藍(lán)分光光度法；活性磷酸鹽采用抗壞血酸還原磷鉬藍(lán)法。水體中的總有機(jī)碳(TOC)則根據(jù)《水質(zhì)總有機(jī)碳的測(cè)定》(HJ501－2009)使用燃燒氧化-非分散紅外吸收法測(cè)定。pH使用便攜式pH計(jì)(HACH，美國(guó))測(cè)定。具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

1.3 DNA提取

每個(gè)水樣(800mL)使用0.22μm的無(wú)菌水系混合纖維素酯膜(Millipore，美國(guó))進(jìn)行抽濾，抽濾后濾膜剪碎放入50mL無(wú)菌離心管中，按照FastDNA™SpinKitforSoil(MPBiomedical，美國(guó))試劑盒的說(shuō)明書，提取水體樣品DNA。提取后將每個(gè)池內(nèi)不同位置的水樣DNA合并，通過(guò)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品質(zhì)量，并使用微量分光光度法(NanoDropND-2000，Thermo，美國(guó))檢測(cè)DNA純度。所有提取的DNA保存在-20℃下以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 ARGs的定量檢測(cè)

ARGs和可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)的檢測(cè)使用SmartChip實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)(WaferGen，美國(guó))的高通量定量PCR技術(shù)(HT-qPCR)完成。本次實(shí)驗(yàn)共設(shè)置267對(duì)ARGs基因引物、28個(gè)MGEs基因引物對(duì)和1對(duì)細(xì)菌通用16SrRNA基因引物。進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，并設(shè)置無(wú)模板對(duì)照。在100nL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為包含50nL2×LightCycler480SYBRGreenIMaster、50ng的DNA模板、80ng牛血清白蛋白(BSA)、前后引物各500nM和無(wú)核酸酶的PCR級(jí)水。熱循環(huán)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性10min，95℃30s和60℃30s循環(huán)40次。熔化曲線分析由程序擴(kuò)增后自動(dòng)生成。根據(jù)SmartChip實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)的檢測(cè)限和靈敏度，儀器的循環(huán)閾值為31。根據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算基因的相對(duì)豐度。

式中：C為基因的拷貝數(shù)；Ct為周期閾值；CG為功能基因(ARGs和MGEs)的相對(duì)豐度；C16SrRNA為16SrRNA基因的拷貝數(shù)。

采用Roche480實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche，美國(guó))根據(jù)外標(biāo)法對(duì)16SrRNA基因進(jìn)行定量。建立從1.39×103拷貝數(shù)·L−1到1.39×109拷貝數(shù)·L−1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括10μL2×LightCycler480SYBRGreenIMasterMix、10µM的前后引物各2μL和、1μLDNA模板，以及7μL無(wú)核酸酶無(wú)菌水。定量PCR(qPCR)反應(yīng)程序如下：在95℃下預(yù)變性30s，60℃下退火延伸60s，72℃下延伸30s，循環(huán)40次。使用陰性對(duì)照測(cè)量16SrRNA的絕對(duì)豐度，1式3份。ARGs和MGEs的濃度通過(guò)將ARGs和MGEs的相對(duì)豐度乘以16SrRNA的絕對(duì)豐度來(lái)計(jì)算。

1.5 Illumina測(cè)序及序列分析

使用通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')對(duì)細(xì)菌16SrRNA的V3~V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的IlluminaMiSeqPE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序完成后，原始fastq文件在Trimmomatic中進(jìn)行質(zhì)控，在FLASH中拼接。使用的UPARSE軟件(version7.1http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體，利用RDPclassifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU115)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%.原始測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至NCBISequenceReadArchive(SRA)。

1.6 數(shù)據(jù)分析與繪圖

采用Origin2021繪制箱線圖和柱狀圖。使用R環(huán)境中的“pheatmap”包繪制熱圖。利用Gephi軟件(版本0.9.2)中的ForceAtlas布局進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，探討ARGs、MGEs和細(xì)菌群落(屬水平)之間的共現(xiàn)模式(基于Spearman相關(guān)和FDR校正)，使用“psych”包計(jì)算細(xì)菌群落、ARGs和MGES之間的相關(guān)性(Spearman)，僅保留強(qiáng)相關(guān)(R>0.7)和顯著相關(guān)(P<0.01)的結(jié)果。使用“pheatmap”包繪制相關(guān)性熱圖，并按照顯著性水平P<0.001、P<0.01和P<0.05做出標(biāo)記。

2、結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中ARGs的分布特征

本研究利用高通量定量PCR技術(shù)對(duì)大連地區(qū)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的養(yǎng)殖池、微濾池、生物濾池和紫外池水體中的ARGs進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果如圖2所示。從循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中共檢出8類201個(gè)亞型的ARGs。其中，四環(huán)素類、多耐藥類和磺胺類是相對(duì)豐度最高的幾類ARGs，其相對(duì)豐度的平均占比分別為30.1%、16.3%和12.3%(圖2(g))。近年來(lái)利用高通量定量PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)到水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境是ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù)，且該技術(shù)具有引物種類豐富和精確定量的特點(diǎn)，也進(jìn)一步揭示了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs更為豐富的多樣性及其耐藥機(jī)制生態(tài)作用。在多數(shù)以PCR方法進(jìn)行檢測(cè)的以往研究中，磺胺類和四環(huán)素類抗性基因被認(rèn)為是我國(guó)海水養(yǎng)殖中常見(jiàn)的抗性基因，占養(yǎng)殖水域總抗性基因的很高比例，本研究也得到了同樣的結(jié)果，說(shuō)明這幾類抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致環(huán)境微生物相應(yīng)的抗生素抗性明顯偏高。盡管國(guó)家已經(jīng)限用或禁用多種抗生素，但磺胺類、四環(huán)素類和氨基糖苷類等抗生素仍然是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中常用的抗生素，其殘留在養(yǎng)殖環(huán)境中誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生ARGs，ARGs在細(xì)菌間水平傳播，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境產(chǎn)生不利影響。通過(guò)MGE的HGT傳播是在不同環(huán)境中傳播抗生素耐藥性的重要途徑，整合子和轉(zhuǎn)座子等MGE是促進(jìn)微生物之間多種基因交換的重要因素。對(duì)于MGE而言，由圖2(h)可見(jiàn)，不同循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中相對(duì)豐度較高的轉(zhuǎn)移元件均為整合子(包括intl2−01和intl2−02)、轉(zhuǎn)座酶基因(包括Tp614)以及IncWrepA、IncQoriT和IncNrep。相比于循環(huán)水水體樣品，海水中的主要轉(zhuǎn)移元件亞型還包括traN、tnpA−06和tnpA−01。

圖2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中ARGs組成和分布特征

對(duì)于ARGs亞型而言，檢出的相對(duì)豐度前50的ARGs亞型如圖2(h)所示。在所有樣品中，相對(duì)豐度最高的ARGs為四環(huán)素類，tetX(8.1%±5.8%)和tetG-02(17.7%±16.2%)分別為蝦場(chǎng)和魚場(chǎng)中相對(duì)豐度最高的ARGs亞型，sul2和floR也是2個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)ARGs亞型，表明不同循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中優(yōu)勢(shì)ARGs種類基本相似，同時(shí)表明循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的ARGs基本來(lái)自于水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的養(yǎng)殖池水。有研究表明，即使不同地理位置，同一養(yǎng)殖品種和相同養(yǎng)殖模式的海水養(yǎng)殖沉積物中ARGs的污染特征相似。另一方面，與DY場(chǎng)的樣品相比，DX樣品中氨基糖苷類的aadA1、aadA−01、aadA−02和aadA2−03，磺胺類的dfrA1和β-內(nèi)酰胺類的blaPSE的相對(duì)豐度較高。而四環(huán)素類tetB、tetR和tetC在DY樣品中較多檢測(cè)到，在DX的水中僅檢測(cè)到較低豐度，這些差異可能與水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境不同有關(guān)，如養(yǎng)殖品種、養(yǎng)殖模式、使用漁藥類型和不同場(chǎng)環(huán)境因子對(duì)ARGs的賦存情況均有較多影響。該循環(huán)水養(yǎng)魚的周期為6~10個(gè)月，循環(huán)水養(yǎng)蝦的周期為4個(gè)月，雖然養(yǎng)殖周期長(zhǎng)利于環(huán)境中ARG在細(xì)菌間傳播，使ARG在循環(huán)水系統(tǒng)水體中積累。然而與魚類養(yǎng)殖相比，對(duì)蝦養(yǎng)殖對(duì)水質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)和管控等方面的要求更為苛刻，養(yǎng)殖過(guò)程中雖未有以抗病和治療為目的的人為添加抗生素，但所購(gòu)買的飼料里難免會(huì)有抗菌藥物存在，以保障對(duì)蝦的健康，顯著增加了蝦池中的ARGs水平，養(yǎng)殖品種也是影響水體中ARG水平的因素之一。此外，實(shí)驗(yàn)僅在對(duì)蝦養(yǎng)循環(huán)水系統(tǒng)中檢測(cè)到萬(wàn)古霉素類ARGs的存在，這類抗生素通過(guò)抑制細(xì)菌胞漿內(nèi)RNA的合成，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成和破壞細(xì)胞膜通透性等，適用于多重耐藥菌的感染。由于其強(qiáng)大的抗菌作用，臨床上被稱為抗生素的最后一道防線。同樣說(shuō)明了與循環(huán)水養(yǎng)魚相比，實(shí)驗(yàn)所選的對(duì)蝦循環(huán)水養(yǎng)殖具有較高的ARGs污染及傳播風(fēng)險(xiǎn)。

在DY場(chǎng)循環(huán)水系統(tǒng)中，雖然ARGs的總絕對(duì)豐度經(jīng)生物濾池后有所減少，但經(jīng)紫外處理后其絕對(duì)豐度有所增加(圖2(b))。這表明經(jīng)DY循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)處理后，水體中ARGs含量并未有所減少。在DX場(chǎng)中，ARGs在各環(huán)節(jié)中的含量也沒(méi)有明顯變化(圖2(a))。DX場(chǎng)和DY場(chǎng)的ARGs豐度變化結(jié)果都說(shuō)明了RAS對(duì)ARGs的去除效果不明顯，經(jīng)循環(huán)水后，水體里依然具有含量豐富的ARGs。DY場(chǎng)的海水中ARGs香農(nóng)指數(shù)明顯高于循環(huán)水樣品的香農(nóng)指數(shù)，表明海水中ARGs種類比魚類養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)的ARGs種類更為多樣(圖2(f))。

2.2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中細(xì)菌群落組成分析

圖3為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，所鑒定出的序列聚類為5366個(gè)操作分類單元(OTU)。2個(gè)不同的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)細(xì)菌群落在門水平上結(jié)構(gòu)相似，在屬水平上則表現(xiàn)出明顯的菌群差異。Alpha多樣性分析結(jié)果表明，2個(gè)循環(huán)水系統(tǒng)的生物濾池水體的香農(nóng)指數(shù)分別為3.54和3.41，顯示出較高的細(xì)菌多樣性(圖3(e)和(f))。海水中菌群香農(nóng)指數(shù)明顯高于循環(huán)水樣品的香農(nóng)指數(shù)，表明海水中細(xì)菌種類比養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌更為多樣。魚類和對(duì)蝦養(yǎng)殖循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中均主要有7個(gè)門類的細(xì)菌(圖3(g))，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)是在所有樣本中普遍存在的細(xì)菌門類。變形菌門為水體中的主要菌群，在DX場(chǎng)和DY樣品的平均相對(duì)豐度分別為47.9%±14.6%和64.3%±10.7%。其次擬桿菌門是豐度第二高的細(xì)菌類群，相對(duì)豐度百分比在2個(gè)系統(tǒng)中分別為35.6%±11.4%和28.6%±7.27%。本實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群與之前報(bào)道的其他海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群一致。海水中的優(yōu)勢(shì)菌群比循環(huán)水系統(tǒng)水體中的更為多樣，Proteobacteria和Bacteroidota在海水中豐度仍然很高，Cyanobacteria和Actinobacteriota也較豐富，高于其在循環(huán)水水體中的豐度。經(jīng)循環(huán)水各環(huán)節(jié)處理后，Chloroflexi的豐度增加，Actinobacteriota和Verrucomicrobiota的豐度相對(duì)減少。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的細(xì)菌豐度的變化規(guī)律與ARGs的變化規(guī)律相似，經(jīng)DX和DY循環(huán)水系統(tǒng)處理后，水體中細(xì)菌豐度未有顯著變化(圖3(a)和(b))。以往研究也發(fā)現(xiàn)，ARGs會(huì)隨著微生物群落的改變而改變，ARGs的增加或減少往往與細(xì)菌群落的增加或減少呈正相關(guān)。

圖3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中細(xì)菌組成和分布特征

在細(xì)菌屬水平上，共獲得874個(gè)細(xì)菌屬，為進(jìn)一步闡明細(xì)菌群落的變化，對(duì)豐度排序的前50個(gè)細(xì)菌屬的組成進(jìn)行了可視化熱圖處理(圖3(h))。由圖3(h)可見(jiàn)，不同循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中主要菌屬豐度組成不盡相同，由此表明不同的養(yǎng)殖環(huán)境形成了不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。unclassified-f-Flavobacteriaceae(16.3%±9.5%)和Lentibacter(10.7%±3.6%)為2個(gè)不同循環(huán)水系統(tǒng)中均為最豐富的細(xì)菌屬。unclassified-f-Rhodobacteraceae也是2個(gè)循環(huán)水系統(tǒng)中豐富的細(xì)菌屬，其豐度大于8.8%。Pseudoalteromonas和HIMB11在2個(gè)循環(huán)水系統(tǒng)水體中也很豐富。而Lentibacter、Pseudoalteromonas和unclassified-f-Rhodobacteraceae在魚類養(yǎng)殖循環(huán)水體中占更多優(yōu)勢(shì)。unclassified-f-Flavobacteriaceae、unclassified-f-Rhodobacteraceae和Glaciecola在對(duì)蝦養(yǎng)殖循環(huán)水中相對(duì)豐度較高。此外，從變化趨勢(shì)來(lái)看，Lentibacter在DY場(chǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)的相對(duì)豐度保持穩(wěn)定。與循環(huán)水系統(tǒng)的前3個(gè)環(huán)節(jié)相比，紫外環(huán)節(jié)中的Psychrobium、Pseudofulvibacter和Photobacterium的檢出豐度明顯減少，相反，Aureimarina和Ruegeria在DY系統(tǒng)的紫外環(huán)節(jié)后豐度卻有所增加。在DX場(chǎng)從養(yǎng)殖池到紫外池的環(huán)節(jié)，HIMB11和Pseudooceanicola的豐度始終穩(wěn)定，說(shuō)明循環(huán)水對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中此類細(xì)菌難以去除。

2.3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中ARGs、MGEs和微生物群落的相關(guān)性

為探索ARGs、MGEs和細(xì)菌群落之間的潛在關(guān)系，對(duì)豐度前50的ARGs、MGE和前50的菌屬進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)共現(xiàn)分析(圖4)，連接線代表節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間具有顯著相關(guān)性(Spearman相關(guān)系數(shù)>0.7，顯著性P<0.5)，節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)間的顯著相關(guān)性成正比。將不同循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)循環(huán)水蝦場(chǎng)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)和邊數(shù)量均多于循環(huán)水魚場(chǎng)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)和邊數(shù)量。對(duì)蝦循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由51個(gè)節(jié)點(diǎn)(23個(gè)ARGs、4個(gè)MGEs和24個(gè)菌屬)和688條邊組成。魚場(chǎng)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)包括34個(gè)節(jié)點(diǎn)(15個(gè)ARGs、3個(gè)MGEs和16個(gè)菌屬)和244條邊。ARGs中的aadA2-03和aac(6')-II、MGE中的ISCR1和intl1、細(xì)菌菌屬中的Aureimarina和unclassified-f-Rhodobacteraceae，分別是ARGs、MGE和細(xì)菌屬在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中的樞紐。

圖4 基于共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析ARGs、MGEs和優(yōu)勢(shì)菌屬的相關(guān)性

細(xì)菌群落與ARGs之間存在連鎖效應(yīng)、協(xié)同選擇和進(jìn)化的相互關(guān)系。一般認(rèn)為當(dāng)微生物與ARGs呈顯著相關(guān)時(shí)，這些微生物可能是ARGs的潛在宿主。對(duì)于同一種ARGs對(duì)應(yīng)多個(gè)微生物顯著相關(guān)時(shí)，代表該抗性基因可能有多個(gè)潛在的微生物宿主。而當(dāng)微生物與ARGs顯著負(fù)相關(guān)時(shí)，這些微生物則影響ARGs的水平轉(zhuǎn)移。因此，使用網(wǎng)絡(luò)共現(xiàn)性來(lái)探索ARGs與微生物間的共現(xiàn)模式，利于推測(cè)攜帶ARGs的微生物宿主。變形菌門是水產(chǎn)養(yǎng)殖水和沉積物中十分重要的細(xì)菌類群，也是最常見(jiàn)的ARGs宿主。本實(shí)驗(yàn)中循環(huán)水養(yǎng)殖水體中變形菌門的細(xì)菌與多種ARGs具顯著正相關(guān)性，如Marinobacterium和nautell等菌屬都與多個(gè)ARGs顯著相關(guān)(圖4)。有研究表明，變形菌門的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)多含有多藥外排泵基因PACE家族，在變形菌門細(xì)菌的抗菌化合物外排過(guò)程具有重要作用。除變形菌門外，其他細(xì)菌門類的細(xì)菌如Rhodobacteraceae和Pseudooceanicola等也發(fā)現(xiàn)與多個(gè)ARGs顯著共現(xiàn)，Rhodobacteraceae為凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的優(yōu)勢(shì)類群，在健康對(duì)蝦腸道中具有較高的相對(duì)豐度，是指示對(duì)蝦健康的關(guān)鍵類群。Aureimarina與aac(6')-II、dfrA1、qacEdelta1-01、strB等8個(gè)ARGs亞型以及intl1和ISCR1等2個(gè)MGE亞型有密切聯(lián)系，這些亞型包括4個(gè)氨基糖苷類，2個(gè)磺胺類，1個(gè)四環(huán)素類，1個(gè)萬(wàn)古霉素類和2個(gè)MGE，Aureimarina可能是循環(huán)水體中這些ARGs的潛在宿主。此外，Litoricola和Alcanivorax與較多ARGs亞型之間也存在共線性。值得注意的是，Nautella與Aureimarina與風(fēng)險(xiǎn)ARGs顯著相關(guān)。這些細(xì)菌與多個(gè)ARGs之間的顯著共現(xiàn)說(shuō)明此部分微生物可攜帶多種ARGs，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)幾種抗生素具有耐藥性，進(jìn)而產(chǎn)生環(huán)境中的多重抗性菌。還有些菌屬如Lentibacter等則只與1種ARGs共現(xiàn)。不同細(xì)菌攜帶ARGs的偏好不同，更多研究應(yīng)加強(qiáng)探究ARGs在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的微生物中水平轉(zhuǎn)移機(jī)制，為由調(diào)控微生物的豐度以達(dá)到消減ARGs提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。此外，雖然有些ARGs如tetA-02和aac(6')-II在循環(huán)水水體中的相對(duì)豐度較低，但其與多種細(xì)菌種屬存在共現(xiàn)性，這不僅說(shuō)明了這些ARGs可能存在多種細(xì)菌宿主，也證明在研究ARGs與細(xì)菌相關(guān)關(guān)系時(shí)，可以適當(dāng)擴(kuò)大所研究的范圍，避免漏掉豐度較低的ARGs亞類。

2.4 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中水體中環(huán)境因子與ARGs、菌群的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)分析的方法探討了環(huán)境因素與ARG，以及環(huán)境因素與細(xì)菌群落之間的關(guān)系，各水體理化因子與豐度前40的ARG亞型的相關(guān)性熱圖如圖5(a)和圖5(b)所示。

圖5 基于Spearman分析的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中水體理化因子和ARG、優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相關(guān)性分析

結(jié)果表明，ARGs的相對(duì)豐度通常與水中的TN、TP、NO3−N、磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)鹽濃度相關(guān)，這與之前的研究結(jié)果相似。磷酸鹽與aacC和oprJ亞型的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，表明磷酸鹽因子能促進(jìn)這些ARGs的產(chǎn)生。在DX循環(huán)水樣品中，多耐藥類的oprJ和氨基糖苷類的aacC的相對(duì)豐度與NO3−N和磷酸鹽均為顯著正相關(guān)(P<0.001)，而四環(huán)素類抗生素的tetX和tetB-01的相對(duì)豐度均與TOC顯著正相關(guān)(P<0.001)，除此以外，其余ARGs與所檢環(huán)境因子之間的相關(guān)性均不是顯著相關(guān)。2個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中的pH與大部分ARGs亞型的相對(duì)豐度之間沒(méi)有正相關(guān)性，但在蝦場(chǎng)循環(huán)水養(yǎng)殖水體中，pH與acrA−05，cmlA1−01和vanC−03等亞型呈正相關(guān)。表明不同循環(huán)水養(yǎng)殖環(huán)境中，相同的理化因子和耐藥基因之間的相關(guān)性不盡相同。

同樣，我們也研究了優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與水體理化因子之間的關(guān)系(圖5(c)和圖5(d))。NO3−N和磷酸鹽理化因子與Ruegeria菌屬的豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，TOC與Mesoflavibacter和Pseudooceanicola呈顯著正相關(guān)(P<0.001)。在魚類循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，NO3−N與Photobacterium和Psychrobium相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，但與Planktomarina菌相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)。磷酸鹽和總磷含量均與Ardenticatenaceae，NS9-marine-group，HIMB11和Cryomorphaceae呈正相關(guān)。循環(huán)水養(yǎng)殖運(yùn)行過(guò)程使用封閉系統(tǒng)，高密度的集約化養(yǎng)殖使水體中的總氮總磷的濃度處于較高水平，為細(xì)菌增殖提供了充足的營(yíng)養(yǎng)條件，因此系統(tǒng)中容易富集更多微生物，如HIMB11，Psychrobium和Photobacterium等菌屬與TN、TP、磷酸鹽和NO3−N都呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01)，表明氮化合物對(duì)這些菌群有較大影響。這些菌群與氮化合物相關(guān)可能源于菌群的反硝化、硝化或氨氧化活性。

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，除所檢水樣的理化因子以外，溶氧、重金屬和溫度等環(huán)境因子，均會(huì)對(duì)ARGs的分布有影響。而且，各種環(huán)境因子與飼料成分、日常管理投喂和水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況等均有十分密切的聯(lián)系。在自然環(huán)境里，決定ARGs分布與變化的因素很難確定，今后可以擴(kuò)大理化因子的檢測(cè)種類，增加樣品采樣數(shù)量，以及通過(guò)構(gòu)建模型預(yù)測(cè)更好地分析水產(chǎn)環(huán)境中的抗生素抗性基因水平。目前，關(guān)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中ARGs污染的研究尚處在開始階段，ARGs在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的賦存、遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律及其影響因子仍有待進(jìn)一步研究。

3、結(jié)論

1)在2個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中共監(jiān)測(cè)到8類抗生素抗性基因，其中四環(huán)素、磺胺類和多藥類ARGs的相對(duì)豐度較高。tetX和tetG-02分別是魚類和蝦類循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中最高的ARGs亞型。

2)變形菌門和擬桿菌門是2個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中的優(yōu)勢(shì)菌門，而不同養(yǎng)殖場(chǎng)水體微生物群落的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的組成不同。水體中多個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬與ARGs之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，表明抗性基因在這些菌屬中易于水平轉(zhuǎn)移與傳播。環(huán)境因素能促進(jìn)ARGs的水平轉(zhuǎn)移，總氮、總磷、氨氮和磷酸鹽是影響循環(huán)水系統(tǒng)中ARGs分布和菌群結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

3)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中ARGs普遍存在且難以消除，需要對(duì)現(xiàn)有的循環(huán)水設(shè)施進(jìn)行調(diào)整，針對(duì)水中ARGs增加新型降解工藝，如使用金屬納米材料作為水凈化膜消除ARGs等，進(jìn)而降低ARGs污染和向環(huán)境中傳播的風(fēng)險(xiǎn)。（來(lái)源：北京市農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院）